胃蛋白酶原ii（pgii）定量測定試劑盒及其制備方法與檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫療器械生物類免疫體外診斷領域，主要涉及一種基于磁微粒分離化 學發光法定量檢測血液中胃蛋白酶原II(PGII)的試劑盒及其制備方法，以及應用該試劑 盒定量檢測血液中胃蛋白酶原II(PGII)的方法。
【背景技術】
[0002] 胃蛋白酶原是胃蛋白酶的前體，根據其生化性質和免疫原性將其分成2個亞群， 1-5組分的免疫原性相同，稱為胃蛋白酶原I，主要由胃底腺的主細胞和黏液頸細胞分泌； 組分6和7被稱為胃蛋白酶原II，除由胃底腺的主細胞和黏液頸細胞分泌外，賁門腺和胃竇 的幽門腺的黏液頸細胞以及十二指腸上段也能產生胃蛋白酶原II。
[0003] 通常情況下，約有1 %的PG透過胃黏膜毛細血管進入血液循環，進入血液循環的 PG在血液中非常穩定；血清PGI和PGII反映胃黏膜腺體和細胞的數量，也間接反映胃黏 膜不同部位的分泌功能；當胃黏膜發生病理變化時，血清PG含量也隨之改變；因此，監測血 清中PG的濃度可以作為監測胃黏膜狀態的手段。
[0004] 血清PG水平反映了不同部位胃粘膜的形態和功能：PGI是檢測胃泌酸腺細胞功能 的指針，胃酸分泌增多PGI升高，分泌減少或胃粘膜腺體萎縮PGI降低；PGII與胃底粘膜 病變的相關性較大（相對于胃竇粘膜），其升高與胃底腺管萎縮、胃上皮化生或假幽門腺化 生、異型增值有關；PGI/II比值進行性降低與胃粘膜萎縮進展相關。因此，聯合測定PGI和 PGII比值可起到胃底腺粘膜"血清學活檢"的作用。
[0005] 在國內，胃蛋白酶原II(PGII)檢測臨床上主要以國外進口試劑和免疫組化試劑 應用為主，國外進口試劑價格非常昂貴，給患者帶來很大的經濟負擔，不利于在基層普及。 具有自主知識產權的國產胃蛋白酶原II(PGII)免疫化學發光檢測試劑盒目前還較少，也 僅停留在96孔微孔板式技術水平上。該技術靈敏度較低、線性窄、特異性較差，也不利于高 通量的全自動檢測。
[0006] 因此，有待開發對胃蛋白酶原II(PGII)檢測靈敏度高與可靠性并能降低檢測成 本的檢測技術。
【發明內容】
[0007] 本發明要解決的技術問題是克服現有的缺陷，提供一種新的可定量檢測胃蛋白酶 原II(PGII)的試劑盒，提高檢測靈敏度及可靠性，并降低成本，延長有效期。
[0008] 為了解決上述技術問題，本發明提供了如下的技術方案：
[0009] -方面，本發明提供了一種胃蛋白酶原II(PGII)定量測定試劑盒，該試劑盒包括 校準品、質控品、抗試劑、磁微粒試劑和發光底物。
[0010] 其中：
[0011] -、胃蛋白酶原II(PGII)校準品、胃蛋白酶原II(PGII)質控品的配制方法如下：
[0012]用標準品緩沖液溶解胃蛋白酶原II(PGII)，配置胃蛋白酶原II(PGII)校準品、 胃蛋白酶原II(PGII)校準品，其中，所述校準品緩沖液是通過在1L新生牛血清中加入 0.Olg~0. 05g的四環素和0.lg~0. 5g硫酸新霉素，溶解后經過0. 22μm濾膜處理制備；
[0013] 二、抗試劑的制備方法如下：
[0014](1)、抗試劑緩沖液的制備：
[0015] Tris :12. 12mg~60. 57mg，四環素：0·Olg~0· 05g，綿羊血清：lg~5g，新生牛血 清3g~10g，馬血清lg~5g加入1L純化水中，充分攪拌至完全溶解；
[0016] (2)、異硫氰酸熒光素與胃蛋白酶原II(PGII)的偶聯，獲得異硫氰酸熒光素標記 的胃蛋白酶原II(PGII)包被抗體：
[0017] 首先用抗試劑緩沖液將異硫氰酸突光素配制成濃度為1. 0~5. Omg/mL的異硫氰 酸熒光素溶液，使用分光光度計在495nm處讀取吸光值，來調整濃度，然后按照胃蛋白酶原 II(PGII)抗體與異硫氰酸熒光素的質量之比為1:1. 1，將二者同時轉移到棕色玻璃瓶中， 室溫下攪拌1~2小時，充分反應后使用pH= 8~9的碳酸氫鹽緩沖液進行平衡，然后凝 膠層析分離純化得到的異硫氰酸熒光素標記的胃蛋白酶原II(PGII)包被抗體；紫外監測， 記錄儀記錄純化圖譜，同時注意確認含有連接物的試管，注意、避光防護。
[0018](3)、堿性磷酸酶與胃蛋白酶原II(PGII)抗體的偶聯，獲得堿性磷酸酶標記的胃 蛋白酶原II(PGII)標記抗體：
[0019] 首先用抗試劑緩沖液將堿性磷酸酶配制成濃度為1. 0~5. Omg/mL的堿性磷酸酶 溶液，可以根據分光光度計在280nm處讀取吸光值，將堿性磷酸酶的吸光值應該在一定的 范圍內。然后按照堿性磷酸酶與胃蛋白酶原Π(PGII)的摩爾比為1:2~1:10的量將二者 轉移至棕色瓶中，室溫下攪拌4~5小時，充分反應后使用pH= 8~9的碳酸氫鹽緩沖液平 衡，然后使用凝膠層析分離純化得到的堿性磷酸酶標記的胃蛋白酶原II(PGII)標記抗體； 注意含有連接物的試管的避光防護。
[0020](4)、將步驟⑵中獲得的異硫氰酸熒光素標記的胃蛋白酶原II(PGII)包被抗體 和和步驟（3)中獲得的堿性磷酸酶標記的胃蛋白酶原II(PGII)標記抗體，加入含有表面活 性劑的Tris鹽緩沖液充，分攪拌后獲得所述抗試劑；所述表面活性劑為Tween20、Triton X-100、Bronidox中的一種或多種，表面活性劑的添加量為0. 01%~0. 5%。
[0021] 三、磁微粒試劑的制備：
[0022] 將抗異硫氰酸熒光素抗體與羧基磁珠偶聯制得磁微粒試劑。
[0023] (1)、取一定體積的充分混勻后的羧基磁珠濃縮液至反應瓶中，將該反應瓶在磁場 放置15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向反應瓶中加入2~5倍于反應瓶中羧基磁 珠體積的磁微粒緩沖液，混勻20-30min。再將反應瓶置于磁場中15min后吸去上清。重復 清洗羧基磁珠3遍。最后將羧基磁珠溶液定容到10-50mg/mL，混勻；所述磁微粒緩沖液的 配置方法是：Tris :12. 12mg，氯化鈉5. 82mg，甲基纖維醚50g，加入1L純化水中，充分攪拌 至完全溶解；
[0024](2)、連接反應：按照羧基磁珠與抗異硫氰酸熒光素抗體質量比為100:1的比例， 在羧基磁珠中加入抗異硫氰酸熒光素抗體，2~8°C內保持混勻狀態反應18小時；
[0025] (3)、反應瓶在在磁場放置15min，待羧基磁珠沉降后用磷酸緩沖液清洗3遍，然后 定容至10mg/mL，2~8°C保存，制得所需待用磁微粒試劑。
[0026] 四、發光底物的制備
[0027] 將ALPS溶解于發光底物緩沖液中制備發光底物。
[0028] 用4~10倍于ALPS體積的發光底物緩沖液充分溶解ALPS，所述發光底物緩沖液 的配置方法是：Tris12. 12g~121. 14g，氯化鈉5. 82g，光澤精0. 03g，加入1L純化水中，充 分攪拌至完全溶解，用鹽酸調節緩沖液的pH至9. 5。
[0029] 進一步的，本發明的胃蛋白酶原II(PGII)定量測定試劑盒，該試劑盒還包括清洗 液。該清洗液主要用于在檢測過程中清洗與磁微粒試劑反應后的樣品，清洗液的具體組分 可以參照所屬領域的常規操作進行。通常是磷酸二氫鈉、氯化納、Tween20和ProcLin300的 混合溶液，在試劑盒制品中可以濃縮清洗液的形式存在，檢測時適當稀釋后使用。優選的清 洗液的配置方法是：Tris12. 12g，氯化鈉5. 82g，Tween-2050mL，曲拉通-100, 50mL，加入1L 純化水中，充分攪拌至完全溶解。
[0030] 另一方面，本發明提供了這種胃蛋白酶原II(PGII)定量測定試劑盒的制備方法， 包括以下步驟。
[0031] 分別配制胃蛋白酶原II(PGII)校準品、胃蛋白酶原II(PGII)質控品、抗試劑、磁 微粒試劑、發光底物；將胃蛋白酶原II(PGII)校準品、胃蛋白酶原II(PGII)質控品、抗試 劑、磁微粒試劑、發光底物獨立地置于包裝容器內，得到胃蛋白酶原II(PGII)的定量測定 試劑盒。
[0032] 本試劑盒的異硫氰酸熒光素標記的胃蛋白酶原II(PGII)包被抗體為能與人體 內胃蛋白酶原II(PGII)抗原特異結合的單克隆抗體，所述堿性磷酸酶標記的胃蛋白酶原 II(PGII)標記抗體為能與胃蛋白酶原II(PGII)抗原特異結合的單克隆抗體。包被抗體和 標記抗體除能與胃蛋白酶原II(PGII)抗原特異性結合外，配對使用時可與抗原形成"三明 治"夾心結構。
[0033] 再一方面，本發明提供了利用這種胃蛋白酶原II(PGII)定量測定試劑盒檢測胃 蛋白酶原II(PGII)的方法，該方法包括步驟：
[0034] (1)取三支試管分別加15μL胃蛋白酶原II(PGII)的校準品、15μL胃蛋白酶原 II(PGII)的質控品、15μL待測樣本；
[0035] (2)每一試管中加入60μL抗試劑，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s，置 37 °C下水浴15分鐘；
[0036] (3)每一試管中加入30μL磁微粒試劑，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s， 置37 °C下水浴5分鐘；
[0037] (4)將三支試管在磁分離器上沉淀2分鐘，緩慢的倒轉試管和磁分離器，倒出上清 液，把倒轉的試管連同磁分離器一起放在濾紙上，用力拍擊磁分離器底部以除去粘在管壁 上的所有液