基于智能水凝膠的禽流感病毒檢測用熒光適配體傳感器的制造方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及快速檢測病毒的方法，尤其是涉及了一種基于智能響應水凝膠的快速 檢測禽流感病毒H5N1的熒光適配體傳感器及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 禽流感是由A型流感病毒引起的禽類感染性疾病。禽流感病毒具有多形性，其中 球形直徑為80~120nm，有囊膜。依據其外膜血凝素Η和神經氨酸酶蛋白N抗原性的不同， 可分為16個Η亞型和9個Ν亞型，其中感染人的禽流感病毒亞型主要為Η5Ν1、Η9Ν2、Η7Ν9 等。高致病性禽流感病毒Η5Ν1已經對全球公共衛生安全造成威脅，導致了巨大的經濟損 失。自從2003年，共有來自全球62個國家/地區的844人受到感染，其中449人因此死亡 (WH0,截止2015年7月17日數據）。2014年底至2015年6月，美國中西部地區爆發了嚴 重的H5亞型禽流感疫情，涉及21州，約4800萬肉雞受到感染（美國農業部，2014年12月 19日-2015年6月17日數據）。因此，人們急需開發出快速、靈敏的檢測方法，應用于禽流 感病毒的現場檢測中。
[0003] 目前檢測禽流感病毒的方法主要包括病毒分離法（金標）、ELISA等免疫法及其衍 生法、PCR及其衍生法、基因法、以及微陣列法等。然而這些方法有的耗時太長、成本過高、 有交叉反應，或要求昂貴的試劑儀器和實驗條件。因此近年來許多學者們致力于研究和開 發簡捷快速的檢測方法，如生物傳感器法，其中已報道的有納米磁珠放大的石英晶體微天 平法、阻抗免疫法、基于納米孔的酶反應安培傳感法等。
[0004] 水凝膠是一種具有交聯結構的三維網狀聚合物，性質柔軟，能保持一定的形狀。聚 丙烯酰胺凝膠因其具有光學透明、易于修飾、制備簡單等優點而被廣泛用于制備智能響應 水凝膠。另外，具有堿基互補配對原則的脫氧核糖核酸（DNA)序列非常適合在單鏈末端設 計、修飾功能基團，并最終整合進入凝膠網絡結構中，從而開發出多樣的傳感器。
[0005] 作為抗體的替代品核酸適配體，擁有包括體積小、可連續合成、可控修飾、無毒、無 免疫原性等在內的眾多優點。因此以核酸適配體為基礎的適配體傳感器常被報道應用于可 視化檢測、分子識別、可控緩釋以及分離等領域。特別地，將適配體作為設計和組成材料，與 水凝膠整合，可個性化制備分子修飾的智能響應水凝膠，用于傳感器開發。例如，Wang和Li 將凝膠固定于QCM傳感器表面，對禽流感病毒進行檢測，但由于QCM易受環境因素的影響 而限制了其現場應用。
[0006] 量子點作為一種新興的熒光標記材料，相較于傳統材料有許多優點，如較寬的激 發光譜和較窄的發射光譜、多種量子點可被同一激發光源同時激發、較大的斯托克斯位移、 較長的熒光壽命、較好的生物相容性等。例如，Liedl等已報道了在DNA聚合物凝膠中如何 限制以及釋放量子點。基于熒光量子點的淬滅法快速、簡便、成本低、靈敏度高，將量子點滲 入凝膠內部，不僅可以保護外界環境對其干擾，同時還可提供了在凝膠結構中充分發揮其 光學特性的條件。
【發明內容】
[0007] 本發明要解決的技術問題是提供一種基于智能響應水凝膠的快速檢測禽流感病 毒H5N1的熒光適配體傳感器及其制備方法和具體使用方法。本發明在總結現有技術問題 的基礎上，結合量子點的熒光淬滅法，提出并開發了一種基于智能響應水凝膠的適配體傳 感器，并利用功能化水凝膠對目標物的響應使其結構發生溶脹-收縮變化，引發量子點與 淬滅劑之間的距離改變，從而導致熒光信號變化，以實現對禽流感病毒H5N1的簡單、穩定、 低成本、高專一性、無標記的快速篩查和現場檢測。
[0008] 為了解決上述技術問題，本發明提供一種基于智能響應水凝膠的快速檢測禽流感 病毒H5N1的熒光適配體傳感器，其特征在于：
[0009] 選擇對禽流感病毒H5N1具有高親和力的DNA核酸適配體作為生物識別元件，通過 對其5'末端修飾丙稀酰胺基（Acrydite)，對其3'末端修飾修飾焚光淬滅基團Iowa BlackK RQ，進行功能化修飾；針對性設計可與核酸適配體序列互補的單鏈DN4和單鏈DNA 2，并在單 鏈DNAj^ 5'末端修飾丙烯酰胺基，在單鏈0嫩2的5'末端修飾熒光量子點；丙烯酰胺基修 飾的DNA鏈在引發劑的催化下能夠聚合形成含有多條DNA支鏈的聚丙烯酰胺鏈；核酸適配 體與單鏈DN4之間的堿基互補配對發揮了交聯劑的作用，使兩種聚合物鏈相互連接，從而 形成水凝膠；當不存在目標物時，由于DNA鏈之間的雜交作用，凝膠處于收縮狀態，量子點 由于距離淬滅劑很近其熒光被淬滅；而當目標物存在時，適配體與目標物的結合導致DNA 鏈之間的雜交被分解，使得凝膠溶脹，造成量子點與淬滅劑之間的距離增大，從而量子點熒 光被恢復。
[0010] 本發明還同時提供了基于智能響應水凝膠的快速檢測禽流感病毒H5N1的熒光適 配體傳感器的制備方法，包括如下步驟：
[0011] -、制備單鏈DNA2-量子點耦合物；
[0012] 將濃度為4~10 μ Μ的單鏈0~六2與濃度為0.5~1.2 μ Μ的量子點溶液混于容器 (例如為一小離心管）中，在室溫攪拌條件下孵育25~35min (較佳為30min)，所述單鏈 DNA2與量子點的摩爾比為：10:1~30:1 ;得單鏈DNA 2-量子點耦合物；
[0013] 備注說明：將制備所得的單鏈DNA2-s；子點親合物存于4 C備用；
[0014] 二、制備單鏈DNA「適配體聚合物水凝膠：
[0015] (1)配置質量濃度〇· 1~20% (質量％ )的丙烯酰胺水溶液作為儲備液；
[0016] (2)配置引發劑-催化劑混合溶液：首先將0.5mL去離子水通氮氣（8~12min， 例如為lOmin)，然后加入0. 05g過硫酸銨和25yL四甲基乙二胺，接著連續通氮氣（8~ 12min，例如為lOmin)，得引發劑-催化劑混合溶液，備用；
[0017] (3)制備適配體-丙烯酰胺聚合物作為溶液I :將0. 5~5 μΜ的適配體溶液 200 μ L通氮氣（4~6min，例如為5min)，然后加入70~80 μ L (較佳為75 μ L)步驟（1)制 備而得的儲備液和l〇〇yL步驟（2)制備而得的引發劑-催化劑混合溶液（新鮮制備），接 著連續通氮氣（8~12min，例如為lOmin)，得溶液I，備用；
[0018] 所述適配體為對禽流感病毒H5N1具有高親和力的DNA核酸適配體；
[0019] (4)制備單鏈DNAi-丙烯酰胺聚合物作為溶液II :將0· 5~5 μΜ的單鏈DNAi溶液 200 μL通氮氣（4~6min，例如為5min)，然后加入70~80 μL(較佳為75 μL)步驟（1)制 備而得的儲備液和l〇〇yL步驟（2)制備而得的引發劑-催化劑混合溶液（新鮮制備），接 著連續通氮氣（8~12min，例如為lOmin)，得溶液II，備用；
[0020] (5)制備水凝膠：將步驟（3)所得的全部的溶液I以及步驟⑷所得的全部的溶 液II混合，然后連續通氮氣（8~12min，例如為lOmin)，接著將其置于36~38°C中保持 10~12小時（較佳為37°C，過夜）以揮發掉部分水分；
[0021] 所得物置于93~97°C變性9~llmin (較佳為95°C變性lOmin)，然后自然降溫至 室溫，得水凝膠。
[0022] 在本發明中，室溫一般是指15~25°C。
[0023] 本發明的基于智能響應水凝膠的快速檢測禽流感病毒H5N1的熒光適配體傳感器 包括單鏈DNA 2-量子點親合物、單鏈DNAi-適配體聚合物水凝膠。
[0024] 作為本發明的基于智能響應水凝膠的快速檢測禽流感病毒H5N1的熒光適配體傳 感器的制備方法的改進：
[0025] 所述單鏈 0熟2的序列為：5' _/5Biosg/CAA CAG GAC AAC-3'。
[0026] 所述單鏈 DNAj9序列為：5' _/5Acryd/ATC CAT GCA CAC-3'。
[0027] 作為本發明的基于智能響應水凝膠的快速檢測禽流感病毒H5N1的熒光適配體傳 感器的制備方法的進一步改進：所述步驟一中，單鏈DNA 2和量子點溶液的用量比為25:1 ; 更佳為：單鏈DNAJ^濃度為5 μ M、量子點溶液的濃度為1 μ Μ ;所述步驟二中，丙烯酰胺水溶 液的質量濃度為〇. 2 %，適配體溶液的濃度為1 μ Μ，單鏈DNAi溶液的濃度為1 μ Μ。
[0028] 本發明制備了單鏈DNA-適配體為基礎的功能化水凝膠，并利用功能化水凝膠對 目標物進行響應，使其結構發生溶脹-收縮變化，引發量子點與淬滅劑之間的距離改變，從 而導致熒光信號變化，實現了對目標物的無標記定量快速檢測。
[0029] 本發明所述的適配體傳感器將兩條修飾