一種檢測肉雞糞便中洛克沙胂及其降解產物的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及化學分析檢測領域，具體涉及一種動物排泄物中有機砷的形態分析檢 測方法。
【背景技術】
[0002] 洛克沙胂（3-硝基-4-羥基苯砷酸，Roxarsone)是一種有機砷（As)化合物，因其 具有抗菌和促生長效果，可作為添加劑在肉雞飼料中使用。洛克沙胂在動物體內很少被降 解，多是以原藥的形式隨糞便排出，進入環境產生嚴重的局部砷污染。在生態環境日趨惡化 的今天，人們對有機砷制劑在環境中的降解、迀移以及對環境生物造成的影響越來越關注， 洛克沙胂主要通過畜禽糞便進入環境，進入環境后，可能通過生物的或非生物的降解反應 轉變為迀移能力更強、毒性更大的含砷化合物，但迄今人們對這一過程還不甚了解。為了研 究洛克沙胂隨畜禽糞便排出后的迀移轉化規律，評估洛克沙胂在環境中的殘留狀況與生態 毒理學，急需建立一種快速準確的方法對洛克沙胂及其降解產物予以分析。
[0003] 有機砷及其降解產物均屬極性化合物，其在復雜環境樣品中的分析方法首選是 高壓液相色譜（HPLC)法，將HPLC的分離優勢與串聯質譜（MS/MS)的鑒別特異性結合，必 能進一步提高檢測的準確度與靈敏度。迄今已有部分利用HPLC-MS/MS檢測有機砷化物 的文獻報道，但研究目標多為檢測土壤和食品基質中的有機砷殘留及其降解產物，而利用 HPLC-MS/MS檢測畜禽排泄物中洛克沙胂轉化產物的研究相對較少。因糞便成分復雜，樣品 基質極大地影響待測化合物在質譜中的離子化，所以必須對樣品進行必要的提取凈化前處 理，以減少基質干擾。
[0004] 然而，前人的研究多著眼于總砷含量及無機砷形態的分析，如現有的關于砷測定 的標準包括：土壤總砷測定的行業標準NY/T1121. 11-2006 ;水質砷測定的行業標準SL 327. 1-2005 ;食品添加劑中總砷測定的國家標準GB/T5009. 76-2003 ;稻米中總砷測定的 行業標準NY/T1099-2006 ;飼料中總砷測定的國家標準GB/T13079-2006 ;以及食品中總 砷及無機砷測定的國家標準GB/T5009. 11-2003,此外，與砷測定有關的專利包括：水產品 中無機砷的測定方法（授權公告號：CN101261258B)等，上述方法均不涉及有機砷形態的 分析測定。由于檢測方法的不完善，導致洛克沙胂通過糞便進入環境后的降解途徑尚不清 楚。因此，尋求一種有效檢測牲畜糞便中洛克沙胂及其有機降解產物也是目前研究環境中 有機砷及其降解產物的首要任務。
【發明內容】
[0005] 本發明的一個目的是針對上述技術缺陷提供一種檢測肉雞糞便中洛克沙胂及其 降解產物的方法。
[0006] 為實現上述目的，本發明首先提供了一種檢測肉雞糞便中洛克沙胂及其降解產物 的方法，包括如下步驟：
[0007] 1)使用甲醇/水作為提取液對糞便樣品進行提取；
[0008] 2)采用固相萃取柱進一步濃縮凈化樣品；
[0009] 3)使用高效液相色譜一離子阱一飛行時間質譜聯用儀進行分析。
[0010] 進一步地，上述步驟可優化為：
[0011] 1)將糞便樣品進行冷凍干燥，在冷凍干燥的樣品中加入體積比為1:9的甲醇/水 溶液進行超聲提取，將提取液進行尚心；
[0012] 2)將固相萃取柱進行固定，活化萃取柱，加入步驟1)中獲得的上清液，再用淋洗 液進行沖洗小柱，淋洗后再用洗脫液進行洗脫，將洗脫液進行過濾；
[0013] 3)使用高效液相色譜一離子阱一飛行時間質譜聯用儀進行分析。
[0014] 本發明的一個優選方面，步驟1)中糞便樣品與甲醇/水溶液的質量體積比是 1:20 ~60g/ml;
[0015] 超聲提取的條件是：室溫下超聲提取30~50min;
[0016] 離心的速率是：10000-15000轉/分鐘。
[0017] 更近一步地，步驟1)可優化為：將糞便樣品進行冷凍干燥，按照樣品與甲醇/水溶 液的質量體積比1:20~60g/ml在冷凍干燥的樣品中加入體積比為1:9的甲醇/水溶液， 在室溫下進行超聲提取30~50min，提取液以10000-15000轉/分鐘速率離心。
[0018] 本發明的另一個優選方面，上述步驟2)中用lmL甲醇和lmL超純水活化萃取柱；
[0019] 加入上清液的量為1ml;
[0020] 沖洗小柱的淋洗液的量為1ml;
[0021] 洗脫小柱的洗脫液的量為1ml;
[0022] 洗脫的速度為1.OmL/min;
[0023] 過濾的條件為：0. 45微米微孔濾膜過濾。
[0024] 其中，上述的淋洗液為體積比為95:5的0· 05mol/L乙酸鈉/甲醇，pH為7 ;洗脫液 為體積比為5:65~75:20~30的甲酸/甲醇/水，pH為2。
[0025] 更近一步地，步驟2)可優化為：將固相萃取小柱固定，用lmL甲醇和lmL超純水活 化萃取柱，然后加入lmL離心所得的提取上清液，再用lmL體積比為95:5的0. 05mol/L乙 酸鈉/甲醇淋洗液沖洗小柱，淋洗后用lmL體積比為5:65~75:20~30的甲酸/甲醇/ 水洗脫液以1.OmL/min的流速洗脫，洗脫液再經0. 45微米微孔濾膜過濾。
[0026] 本發明的有益效果：本發明首先是根據洛克沙胂的理化性質，選取水相比例較高 的提取液對復雜基質中的微量待測物進行有效提取，并根據其等電點，調節洗脫液的pH值 保證洛克沙胂被充分洗脫，提高回收率。試驗結果表明采用體積比為1:9的甲醇/水提取 雞糞樣品中的洛克沙胂殘留，可以獲得較高的提取率。此外，本發明再采用固相萃取柱進一 步凈化樣品時，使用的是經多次優化獲得的pH為2,體積比為5:65~75:20~30的甲酸 /甲醇/水的洗脫液，該優化的洗脫液既能保證獲得理想的回收率，又能去除樣品中的一些 極性化合物雜質，以降低質譜檢測中的背景干擾。利用高壓液相色譜法分析該方法的加標 回收率，結果表明，外標均有較高的回收率，可見本發明提供的分離方法的回收率能滿足后 續檢測的要求，因而是非常理想的分離肉雞糞便中洛克沙胂及其降解產物的方法。
[0027] 本發明提供的利用高效液相色譜一離子阱一飛行時間質譜聯用儀（LCMS-IT-T0F) 檢測肉雞糞便中的洛克沙胂及其降解產物的方法，經離子阱一飛行時間串聯質譜分析后表 明，洛克沙胂（質譜中的相對質荷比為m/z261. 94)在肉雞糞便中的降解產物有以下三種， 分別為：4-羥基-3-硝基苯基二氧化砷（m/z243. 92) ;4-羥基-3-硝基苯酚（m/z153. 01) 和3,4-二羥基苯酚（m/z122. 91)。可見，利用離子阱一飛行時間多級串聯質譜分析洛克沙 胂及其降解產物的方法具有簡單易行，高效準確的特點。
【附圖說明】
[0028] 圖1為實際樣品的液相色譜圖，其中洗脫時間為7. 2min的特征峰為洛克沙胂；以 及
[0029]圖2為洛克沙胂以及三種代謝產物的質譜檢測結果，其中（2a)中①為質荷比 為261. 93的洛克沙胂（3-硝基-4-羥基苯砷酸）；（2b)中②為質荷比為243. 92的4-羥 基-3-硝基苯基二氧化砷；（2c)中③為質荷比為153. 01的4-羥基-3-硝基苯酚；（2d)中 ④為質荷比為123. 01的3,4-二羥基苯酚。
【具體實施方式】
[0030] 目前現有的畜禽糞便樣品處理方法中，洛克沙胂加標回收率太低，不能滿足檢測 要求，其原因可能是洛克沙胂與糞便樣品中的金屬離子等雜質相結合形成難提取物質，本 發明為了克服上述技術缺陷，首先根據洛克沙胂的理化性質，選取水相比例較高的提取液 對復雜基質中的微量待測物進行有效提取，并根據其等電點，調節洗脫液的pH值保證洛克 沙胂被充分洗脫，提高回收率。試驗結果表明采用體積比為1:9的甲醇/水溶液提取雞糞 樣品中的洛克沙胂殘留，可以獲得較高的提取率，而且采用固相萃取柱進一步凈化樣品時， 優化的pH為2,體積比為5:65~75:20~30的甲酸/甲醇/水的洗脫液既能保證獲得理 想的回收率，又能去除樣品中的一些極性化合物雜質，以降低質譜檢測中的背景干擾，因而 是較為理想的前處理方法。
[0031] 本發明又采用離子阱一飛行時間聯用質譜儀對預處理過得樣品進行檢測，本發明 所用的離子阱一飛行時間聯用質譜儀是將高效液相色譜和離子阱質譜儀（IONSTRAP)以及 飛行時間質譜儀（TOFMS)串聯起來，其在準確質量數分辨率和靈敏度方面較其它質譜法有 較大提高，能夠準確提供分子的質量信息，增加了分子式確定的可信度，是鑒定有機化合物 的有力手段。故本發明利用LCMS-IT-T0F質譜儀鑒定有機化合物分子結構的優勢，檢測肉 雞糞便中洛克沙胂及其有機降解產物。
[0032] 下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細的說明，但不應理解為對本發明的 限制。在不背離本發明精神和實質的前提下，對本發明所作的修飾或者替換，均屬于本發明 的范疇：
[0033] 實施例1肉雞糞樣中洛克沙胂回收試驗
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