基于目標分子發卡組裝的鈾酰離子傳感器、其制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及電化學傳感器領域，尤其鈾酰離子檢測領域，具體為一種基于目標分 子發卡組裝的鈾酰離子傳感器、其制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] -直以來，設計一種能與高靈敏和高選擇性的分析儀器相媲美的金屬離子傳感器 是一個巨大的挑戰。由于很多金屬離子的帶電電荷、離子半徑和其他性質都非常相似，致使 在其它金屬離子的干預下，準確探測超低濃度的金屬離子困難很大（參考文獻：Hitomiet al. , 2001；Nolanetal. , 2003；Chenetal. , 2005)〇
[0003] 鈾作為重要的天然放射性元素，也是最重要的核燃料，具有化學毒性和放射性，因 而在過去半個世紀里受到廣泛關注。鈾經濃縮后，被廣泛應用于核能發電和核武器領域， 因此人類暴露在鈾環境中的幾率大增，對人體存在長期的健康危害（Zoriyetal.，2010; Rozmari0etal.，2009Jonesetal.，2007)。因此，需要對鈾污染狀態的評估和環境修復 進行監測。
[0004] 到目前為止，已有許多常規檢測鈾的技術，主要包括X-射線熒光光譜（參考 Rathoreetal.，2008)、電感親合等離子體原子發射光譜（參考Dejeantetal.，2014)、高 效液相色譜（參考Jaisonetal·，2014)和質譜（參考Xuetal·，2014)等。雖然大部分 基于前述方法的儀器具有靈敏度高和選擇性好的特點，但這些儀器大都存在分析成本高、 設備造價昂貴、儀器笨重等缺點，無法適用于現場實時探測的需要。因此，發展一種簡單、方 便、在線和實時探測鈾的超靈敏分析方法變得十分迫切（參考Mehtaetal.，2011)。
[0005] 在公開文獻中，已經報道了一些可用于探測水溶液中鈾酰離子的化學和生物傳感 器（參考Liuetal.，2007)，但大部分仍無法比擬傳統儀器方法所具有高靈敏度和高選 擇性（參考Shuetal·，2015;Jarczewskaetal·，2014;Badretal·，2014;Beckeret al·，2009;Banerjeeetal·，2010 ;) 〇
[0006] 為此，迫切需要開發一種簡單、便攜、在線和實時探測鈾的、靈敏度高、選擇性好的 裝置和/或方法。
【發明內容】
[0007] 本發明的發明目的在于：針對目前傳統檢測鈾的儀器存在分析成本高、設備造價 昂貴、儀器笨重等缺點，無法適用于現場實時探測的需要，而現有用于探測水溶液中鈾酰離 子的化學和生物傳感器存在靈敏度和選擇性不高的問題，提供一種基于目標分子發卡組裝 的鈾酰離子傳感器、其制備方法及應用。本發明首次提出了利用DNA酶和HCR放大策略來探 測鈾酰離子的方法，結合U022+-特異性DNA酶和HCR放大技術，本發明的探測限值為20pM， 能夠超靈敏檢測鈾酰離子，有效解決了現有化學和生物傳感器所存在的靈敏度和選擇性不 高的問題。同時，本發明具有簡單、方便、易于攜帶，能實時、在線檢測鈾酰離子的濃度，具有 較好的應用前景。
[0008] 為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0009] 基于目標分子發卡組裝的鈾酰離子傳感器，包括金電極、設置在金電極上的敏感 層，所述敏感層為通過Au-s鍵修飾到金電極表面的鈾酰離子特異性DNA酶，鈾酰離子特異 性DNA酶由酶鏈DNA和巰基修飾的底物DNA組成。
[0010]所述巰基修飾的底物DNA的序列為HS-(CH2)6TCCTCTAATACACTCACTATrA GGAAGAGATGGACGTG;所述酶鏈DNA的序列為CACGTCCATCTCTGCAGTCGGGTAGTT AAACCGACCTTCAGACATAGTGAGT〇
[0011] 前述鈾酰離子傳感器的制備方法，包括如下步驟：
[0012] ⑴制備反應液
[0013] 在反應器中分別加入等摩爾量的巰基修飾的底物DNA和酶鏈DNA，再向反應器中 加入含氯化鈉的2- (N-嗎啡啉）乙磺酸緩沖液，調節pH值至5. 0-6. 0,旋渦振蕩，使反應器 內的組分混合均勻，得樣品，將樣品加熱至80-90°C后，加熱后的樣品經2-4小時冷卻至室 溫，得到反應液；
[0014] ⑵裝配
[0015] 將金電極用氧化鋁粉末在拋光布上拋光后，依次采用超純水、無水乙醇超聲洗滌， 再將洗滌后的金電極放入硫酸溶液中進行電化學清洗，并用氮氣干燥，再將干燥的金電極 插入到步驟1制備的反應液中靜置2~5小時，得第一金電極，然后用6-巰基正己醇浸泡 第一金電極1~3h，去除第一金電極上特異性吸附的DNA，最后將用6-巰基正己醇浸泡后 的第一金電極用PBS緩沖液清洗，即得鈾酰離子傳感器。
[0016] 所述步驟1中，反應器采用1. 5mL離心管，在1. 5mL離心管中加入30-60μL 80-120μΜ巰基修飾的底物DNA和等摩爾量的酶鏈DNA，再向離心管中加入800-1000μL含 300-800mMNaCl的30-80mM2- (Ν-嗎啡啉）乙磺酸緩沖液，調節pH值至5-6,旋渦振蕩，使 反應器內的組分混合均勻，得樣品，將樣品加熱至80-90°C后，加熱后的樣品經2-4小時冷 卻至室溫，得到反應液。
[0017] 所述步驟2中，將金電極用0. 05μm的氧化鋁粉末在拋光布上拋光后，依次采用超 純水、無水乙醇超聲洗滌2~8min，再將洗滌后的金電極放入0. 5mol/L(即0. 5M)的硫酸溶 液中進行電化學清洗，并用氮氣干燥，再將干燥的金電極插入到步驟1制備的反應液中靜 置3小時，得第一金電極，然后用6-巰基正己醇浸泡第一金電極2h，去除第一金電極上特異 性吸附的DNA，最后將用6-巰基正己醇浸泡后的第一金電極用PBS緩沖液清洗，即得鈾酰離 子傳感器。
[0018] 前述鈾酰離子傳感器的應用，包括如下步驟：
[0019]A、將待測溶液滴到鈾酰離子傳感器表面；
[0020] B、將氏和Η2分別加熱至80-90°C保溫5-8min后，分別在2-4小時內冷卻至室溫， 分別得到氏發卡結構、Η2發卡結構；
[0021]C、將步驟Α中滴有待測溶液的鈾酰離子傳感器用超純水洗滌后，將洗滌后的鈾酰 離子傳感器插入含氏發卡結構、Η2發卡結構的第一緩沖溶液中，進行雜交鏈式反應1. 5-5 小時；
[0022] D、將步驟C中經雜交鏈式反應后的鈾酰離子傳感器浸泡于第二緩沖液中 5-20min，然后將浸泡后的鈾酰離子傳感器用超純水清洗，去除鈾酰離子傳感器上非特異性 吸附的亞甲基藍；
[0023]E、將步驟D處理后的鈾酰離子傳感器進行方波伏安法測試，測定電流強度；
[0024]F、根據步驟E測定的結果，得出鈾酰離子濃度；
[0025]所述氏的序列為AATACACTCACTATGAATGAATAGTGAGTGTATTAGAGGA，所述H2的序 列為TCATTCATAGTGAGTGTATTTCCTCTAATACACTCACTAT;
[0026] 所述步驟C中，第一緩沖溶液為含NaCl的2- (N-嗎啡啉）乙磺酸緩沖液，2- (N-嗎 啡啉）乙磺酸的摩爾濃度為30-80mmol/L，NaCl的摩爾濃度為0. 3-0. 8mol/L;
[0027] 所述步驟D中，第二緩沖溶液為含亞甲基藍的PBS緩沖液，PBS的摩爾濃度為 8-12mmol/L，亞甲基藍的摩爾濃度為15-25ymol/L;
[0028] 所述第三緩沖溶液為8-12mmol/LPBS緩沖液。
[0029] 所述步驟A中，將待測溶液滴到鈾酰離子傳感器表面反應8_12min。優選lOmin。
[0030] 所述步驟B中，將氏和Η2分別加熱至80-90°C保溫5min后，分別在2-4小時內冷 卻至室溫，分別得到氏發卡結構、Η2發卡結構。
[0031] 所述步驟C中，第一緩沖溶液為含NaCl的2- (Ν-嗎啡啉）乙磺酸緩沖液，2- (Ν-嗎 啡啉）乙磺酸的摩爾濃度為30-80mmol/L，NaCl的摩爾濃度為0. 3-0. 8mol/L，第一緩沖溶 液的pH值為6. 5-7. 5。
[0032] 所述步驟D中，第二緩沖溶液為含亞甲基藍的PBS緩沖液，PBS的摩爾濃度為 10mmol/L，亞甲基藍的摩爾濃度為20ymol/Lo
[0033] 所述步驟D中，將浸泡后的鈾酰離子傳感器用超純水清洗10s。
[0034] 所述步驟E中，將步驟D處理后的鈾酰離子傳感器轉入第三緩沖溶