納米粒子的nmr食源性致病菌快速檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種致病菌的快速檢測方法，尤其涉及一種基于CoFe204納米粒子的NMR食源性致病菌快速檢測方法。
【背景技術】
[0002]基本原理:單克隆抗體或抗原分子與酶分子通過共價鍵結合，這種結合不會改變單克隆抗體、抗原和酶的免疫學特性及生物活性，特異性的單克隆抗體只會與特異性的抗原結合。CoFe204納米粒子為抗體修飾改性的CoFe 204納米粒子，CoFe 204由于具有元素Co,具有高飽和磁化強度，在粒徑小到一定程度時，會出現超順磁特性。因此，其粒子對周圍水分子的核磁共振自旋-晶格弛豫時間的影響非常大。這也就是這類物質作為造影劑的機理。非常微量的納米CoFe204就會造成水的核磁共振自旋-晶格弛豫時間大幅下降，通過空白對照就能明確，是由于存在這種物質引起的。因此可以構建CoFe204納米粒子生物傳感器，從磁共振的角度來做檢測。
[0003]其主要的原理步驟:(1)檢測目標菌的特異性CoFe204納米粒子的制備。從市場上購買CoFe204納米材料，也可以通過其他化學合成方法制備納米級的CoFe 204。使用娃燒偶聯劑或PEG(聚乙二醇)，修飾提高生物相容性，其通式為:Y(CH2)nSiX3。此處，η為0_3 ;Χ為可水解的基團；Υ為有機官能團。X通常是氣基、甲氧基、乙氧基、乙醜氧基等，這些基團水解時即生成硅醇(Si (0Η)3)，而與無機物質結合，形成硅氧烷。Υ是乙烯基、氨基、環氧基、甲基丙烯酰氧基、巰基。這些反應基團可與有機物質反應而結合。因此，通過使用硅烷偶聯劑，可在無機物質和有機物質的界面之間架起“分子橋”，把兩種性質懸殊的材料連接在一起提高復合材料的性能和增加粘接強度的作用。再通過修飾特異性抗體可實現表面功能化，形成特異性粒子，再封閉多余的活性位點。(2)采用常規方法將待檢目標菌的特異性單抗固定在酶標板表面，并將多余活性位點封閉，備用。(3)將待檢樣品加到第(2)步制得的固定了目標菌單抗的酶標板上孵育20mins，若樣品中存在目標菌，則目標菌會與酶標板上的單抗結合，通過洗滌，則目標菌被固定在酶標板上。(4 )將第(1)步所制的抗體修飾的CoFe204納米粒子加入第3)步所得到的酶標板上，此時，如果酶標板上有目標菌，通過粒子的特異性反應，則粒子會與酶標板上的目標菌發生特異性結合，形成雙抗夾心結構，此時用無菌的去離子水清洗，就可以將沒有結合的粒子洗去。在酶標板上剩下的就只有結合目標菌的粒子。若酶標板上沒有目標菌，則所以粒子都被洗去。(5)加入定量的洗脫液(30%甲醇)將酶標板上的結合了目標菌的粒子洗脫下來。得到的溶液，用核磁共振儀(CuteNMR，寧波健信公司)測定溶液的自旋-晶格弛豫時間。以無菌的去離子水重復上述步驟作為空白，溶液測得的自旋-晶格弛豫時間與空白相比較，有顯著差異，說明溶液中有粒子存在，從而說明樣本中有目標菌，粒子的量與自旋-晶格弛豫時間和自旋-自旋弛豫時間的下降值呈正比。下降的越多說明粒子越多，從而間接說明目標菌越多，通過加標驗證定量檢測樣本中目標菌的數目。
[0004]該方法的主要優點就是快速、靈敏度高。相對于致病菌的微生物培養2-3天甚至幾天的時間。此方法主要取決于樣品的預處理時間，核磁共振檢測只需幾分鐘。所有的食品標準，致病菌都不得檢出。因此，用該方法可做大規模待檢樣品的陽性篩選，一定程度上可以定量檢測。
【發明內容】
[0005]—種基于CoFe204納米粒子的NMR食源性致病菌快速檢測方法，用于對各種不同的食品樣品進行評價。該方法是一種客觀有效的檢出食品中有害致病菌的方法，從而在某種程度上大大縮減了食品樣品有害致病菌的篩選時間。
[0006]—種基于CoFe204納米粒子的NMR食源性致病菌快速檢測方法，核磁共振儀對順磁物質的響應敏感性，提出核磁共振弛豫參數變化與CoFe204納米粒子含量的相關性指標。
[0007]該方法依賴于建立的可用于食品樣品中有害致病菌特異性CoFe204納米粒子的分離，從核磁共振弛豫時間變化的角度，檢測出樣品中的有害致病菌。由于核磁共振儀自旋-晶格弛豫效率和自旋-自旋弛豫效率對CoFe204納米粒子非常敏感，即在去離子水中，存在微量的CoFe204納米粒子，則水的自旋-晶格弛豫時間和自旋-自旋弛豫就會顯著下降。通過定量檢測出樣品中的免疫粒子含量，從而可以間接定量出食品樣品中的有害致病菌含量。檢測出的致病菌含量與粒子含量線性相關，擬合度較好。最終以免疫粒子與致病菌間的對應關系為紐帶，確定食品樣本中的致病菌菌落數。所有的食品標準，致病菌均不得檢出。因此，該方法可做大規模待檢樣品的陽性篩選，一定程度上可以定量檢測。
[0008]本發明是這樣實現的，步驟如下。
[0009](1)檢測目標菌的特異性CoFe204納米粒子的制備。
[0010](2)將目標菌特異性單抗固定在酶標板表面，病封閉多余活性位點。
[0011](3)將待檢樣品加到第(2)步制得的固定了目標菌單抗的酶標板上孵育20mins，若樣品中存在目標菌，則目標菌會與酶標板上的單抗結合，通過洗滌，則目標菌被固定在酶標板上。
[0012]( 4 )將第(1)步所制的抗體修飾的CoFe204納米粒子加入第(3)步所得到的酶標板上，此時，如果酶標板上有目標菌，通過粒子的特異性反應，則粒子會與酶標板上的目標菌發生特異性結合，形成雙抗夾心結構，此時用無菌的去離子水清洗，就可以將沒有結合的粒子洗去。在酶標板上剩下的就只有結合目標菌的粒子。若酶標板上沒有目標菌，則所以粒子都被洗去。
[0013]( 5 )加入定量的洗脫液(30%甲醇)將酶標板上的結合了目標菌的粒子洗脫下來。得到的溶液，用核磁共振儀(CuteNMR，寧波健信公司)測定溶液的自旋-晶格弛豫時間。以無菌的去離子水重復上述步驟作為空白，溶液測得的自旋-晶格弛豫時間與空白相比較，有顯著差異，說明溶液中有粒子存在，從而說明樣本中有目標菌，粒子的量與自旋-晶格弛豫時間和自旋-自旋弛豫時間的下降值呈正比。下降的越多說明粒子越多，從而間接說明目標菌越多，通過加標驗證定量檢測樣本中目標菌的數目。
[0014]所述粒子為具有順磁特性的CoFe204納米材料，納米粒徑小于500納米。
[0015]所述的目標菌的最終檢出評價方法基于核磁共振弛豫時間的變化。
[0016]所述弛豫時間特性，是指自旋-晶格弛豫時間和自旋-自旋弛豫時間。
[0017]本發明的有益效果:本發明提供一種客觀的快速檢測出食品中的有害致病菌的方法，其特征是依賴于建立的可用于檢測CoFe204納米粒子的核磁共振檢測方法。該方法可以客觀有效地對食品中有害致病菌進行檢測，相比于致病菌的生物培養確認，該方法具有快速檢測的優勢，可以用于大規模樣本的快速篩選。
【具體實施方式】
[0018]本發明將通過以下實施例作進一步說明。
[0019]實施例1。
[0020]檢驗食品樣本測定其是否含有有害致病菌一一單增李斯特菌。
[0021]l、CoFe204納米粒子制備:CoFe 204納米粒子可以從市場購買，也可以參考文獻用化學方法合成。將得到的CoFe204與PEG-1500按質量比1:10在無水乙醇的溶解下，加入反應釜中，密封完畢后放入烘箱中，將溫度調至90°C，反應12小時；當反應釜降至室溫時，一般是在關閉烘箱后的3-4h即可。打開反應釜，將上清液倒去，用無水乙醇洗滌并攪拌；洗滌完一次就進行一次離心，直到上清液澄清為止。轉速8000r/min，時間3min ;將洗滌好的最終產品放在烘箱中自然晾干，得到PEG修飾的CoFe204納米粒子。
[0022]抗體修飾:稱取一定量的羧基修飾的CoFe204納米粒子，加入2倍質量的EDC和NHS，加入0.01M的PBS各lmL。放在混勻儀上，轉速15轉，反應45min。)將活化時間到的樣品進行10000r/min離心，時間5min，然后再加入0.01M的PBS進行洗滌離心，重復3次。將離心完的樣品各加入過量的單增李斯特菌抗體，在混勻儀上偶聯lh。偶聯完成后加入的10%BSA封閉液45min。封閉結束后，轉速8000r/min離心分離5min，用0.01M的PBS清洗離心，重復3次，則將多余的抗體、BSA洗去，