一種水體中氯霉素cap的定量檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于痕量抗生素檢測技術領域，具體涉及一種水體中氯霉素CAP的定量檢 測方法，尤其是一種通過磁性微粒實現物理分離的拉曼光譜標記探測技術定量檢測水體中 氯霉素CAP的方法。
【背景技術】
[0002] 氯霉素（Chloramphenicol，CAP)是一種抑菌性廣譜抗生素，且是世界上首種完全 由合成方法大量制造的廣譜抗生素。其對很多不同種類的微生物均起顯著作用。但由于其 會引起致命的再生不良性貧血這一副作用，因此目前已被國際上大部分國家禁用。但近年 來常有抗生素污染事件發生，因此準確快速檢測抗生素（氯霉素）具有非常重要的意義。目 前，氯霉素的檢測主要有色譜-質譜聯用、酶聯免疫等方法。色譜-質譜聯用法由于操作繁 瑣、成本高、分析速度慢等缺點無法得到普遍推廣。而酶聯免疫試劑盒雖然選擇性好、操作 方便，但價格昂貴、貯藏條件苛刻，假陽性比較高，并且檢測限較高，滿足不了快速準確的檢 測要求。
[0003] 作為一種近幾年快速發展的分析檢測手段，表面增強拉曼標記技術是一種非常新 穎的光譜標記方法，其相對于其他檢測方法的優勢主要體現在：①檢測條件溫和、簡便，可 以方便的用于水溶液檢測；②增強因子最高可達1〇 14~10 15,具有超高的檢測靈敏度，可以 實現單分子檢測；③高度的分子特征性，可以在極其復雜的體系中僅僅增強表面的目標分 子或基團，具有很好的選擇性。
[0004] 在傳統的拉曼光譜免疫分析檢測中，最常用的檢測基底為固相基底。該種技術涉 及到眾多且重復的對于固相基底的清洗步驟；在固相基底上，檢測物與檢測試劑之間所需 要的結合時間過長，效率低。同時，通過清洗的方法來去除未參與反應的殘留的示蹤分子， 這一過程并不能保證殘留物的徹底清除，對于后續的信號檢測會產生干擾。
[0005] 此外，早前關于拉曼光譜免疫分析的研究主要集中在蛋白質、DNA、微生物檢測等 方面，這些大分子物質一般具有多個結合位點，能夠很好的適用于傳統的三明治結構。而氯 霉素是一種典型的小分子物質，缺少多個結合位點，采用拉曼免疫分析中傳統的"三明治" 結構難以對其實現檢測。基于拉曼光譜分析技術的優點，因此，發展一種新的應用拉曼光譜 標記技術簡單快速檢測氯霉素的方法顯得十分重要。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種水體中氯霉素CAP的定量檢測方法，該檢測方法溫 和、簡便，檢測的靈敏度更高，檢測區間廣。
[0007] 因此，本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：一種水體中氯霉素CAP 的定量檢測方法，包括以下步驟：
[0008] (1)將拉曼信號示蹤分子和CAP-BSA結合到貴金屬微粒表面，制備成免疫光譜標 記處理的貴金屬微粒A溶液，其中BSA為牛血清白蛋白；
[0009] ⑵采用活化劑活化表面修飾有羧基的磁性微粒，隨后加入CAP抗體，制備成修飾 有CAP抗體的磁性微粒B溶液；
[0010] (3)選取CAP標準溶液，用三蒸水稀釋制成一組具有濃度梯度的樣品液；
[0011] (4)將步驟（1)中的A溶液和步驟（3)的一組具有濃度梯度的樣品液中的每一份 分別加入到步驟（2)得到的B溶液中，則樣品液中的CAP和A溶液中的CAP-BSA同時與溶 液B中的CAP抗體特異性結合；
[0012] (5)利用磁場分離磁性結合物，保留上清液，用顯微拉曼光譜儀對上清液中殘留的 貴金屬微粒上拉曼信號示蹤分子進行信號采集，根據步驟（3)的樣品液中CAP濃度和拉曼 信號強度的對應關系，繪制標準曲線；
[0013] (6)取待測水樣品，經過濾、離心除雜，并用三蒸水稀釋以消除基質影響后，根據該 待測水樣品獲得的拉曼光譜信號強度，代入步驟（5)中的標準曲線讀出CAP的濃度，乘以相 應的稀釋倍數即為待測水樣品中CAP的濃度。
[0014] 在上述水體中氯霉素CAP的定量檢測方法中：
[0015] 步驟（1)中所述的拉曼信號示蹤分子優選為4, 4'-聯吡啶，該分子一邊可以連接 在貴金屬微粒表面，另一邊可以和CAP抗體相連，是雙官能團標記分子。
[0016] 步驟⑴中將拉曼信號示蹤分子和CAP-BSA結合到貴金屬微粒表面后，再采用BSA 封閉剩余活性位點，其中剩余活性位點是指貴金屬微粒表面未結合拉曼信號示蹤分子和 CAP-BSA的部分。
[0017] 步驟（1)中所述的貴金屬微粒為膠體金；其平均粒徑優選為30~35nm。
[0018] 步驟（1)中免疫光譜標記處理的貴金屬微粒的制備方法可參考2011年10月19 日公開的中國專利"應用競爭性表面增強拉曼散射檢測克倫特羅的方法及應用"，公開號 102221542A。僅把CAP-BSA換成克倫特羅抗體。
[0019] 步驟（2)中所述的表面修飾有羧基的磁性微粒為表面修飾有羧基的四氧化三鐵 Fe304，其粒徑優選為400~500nm。
[0020] 步驟（2)中所述的活化劑優選為1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)。
[0021] 步驟（3)中所述的CAP標準溶液的濃度優選為0. 05~lmg/mL。
[0022] 步驟（3)中所述的一組具有濃度梯度的樣品液優選為含有0、1、10、100、1000和 10000pg/mL的CAP溶液，其中，Opg/mL為對照。
[0023] 步驟（4)中所述的A溶液的濃度優選為0.95~1. 05mmol/L，其與樣品液的體積比 優選為4. 5~5. 5 :1，所述的B溶液的濃度優選為0. 4~0. 6mg/mL，其與所述的A溶液的體 積比優選為1 :1. 0~1. 25。
[0024] 溶液A和不同濃度樣品液的比例會影響最低檢測限的大小；而溶液A和溶液B的 比例會影響到背景信號的大小，因此需要對三者之間的用量關系進行研究，本發明經過試 驗發現，當采用上述比例的用量關系時，最低檢測限和背景信號大小合適。
[0025] 步驟（5)和步驟(6)中所述的拉曼信號強度是通過顯微拉曼光譜儀測得；所述的 顯微拉曼光譜儀的操作條件優選為激發光源是波長為632. 8nm的He-Ne激光器，到達樣品 的激光功率為lmW，信號收集時間為10~60s。
[0026] 步驟（5)中所述的拉曼信號強度是選取拉曼信號示蹤分子的特征拉曼譜峰作為 定量峰，并以CAP濃度對該譜峰光譜強度作圖，線性擬合，并以此繪制標準曲線。
[0027] 步驟(6)中所述的拉曼信號強度也是選取拉曼信號示蹤分子的特征拉曼譜峰作 為定量峰。
[0028] 本發明步驟（5)中是通過檢測溶液的拉曼光譜信號得到相應的結果，相比于傳統 的檢測固相基底的方法，溶液中的拉曼光譜信號檢測數據更加穩定可靠且可大量重復。
[0029] 本發明步驟（5)中是利用磁場物理作用分離磁性結合物與上清液，相比于傳統的 清洗固相基底來去除殘留物的步驟，此方法更加簡便、高效。
[0030] 本發明中的水體中氯霉素CAP的定量檢測方法，是將CAP與免疫光譜標記處理的 貴金屬微粒（微粒A)依次添加到修飾CAP抗體的磁性微粒（微粒B)溶液中，CAP和溶液A 中的CAP-BSA同時與溶液B中的CAP抗體特異性結合，反應結束后，通過磁場物理分離，保 留上清液，通過顯微光譜儀檢測上清液中殘留的貴金屬微粒上示蹤分子的拉曼光譜信號， 根據檢測信號相對強度與CAP濃度的一一對應關系，間接測得氯霉素溶液的濃度，實現對 CAP的定量檢測。
[0031] 工作原理是：在收集時間一定的情況下，對于同一種拉曼信號示蹤分子，信號強度 和免疫光譜標記處理貴金屬微粒上示蹤分子的濃度成正相關，正是在此基礎上實現了定量 檢測。
[0032] 與現有技術相比，本發明具有如下優點：
[0033] (1)本發明將免疫光譜標記處理的貴金屬微粒用于CAP的定量檢測，將拉曼光譜 信號強度和物質的濃度聯系起來，類似于朗伯比爾定律，從而實現定量檢測；
[0034] (2)傳統的表面增強拉曼散射只能檢測含有多個結合位點的分子，即形成典型的 三明治結構，對于像CAP這種小分子半抗原卻檢測不了，本發明可以彌補這種方法的不足， 實現小分子檢測，因此本發明對環境監測與保護將會有重要作用；
[0035] (3)本發明是通過檢測溶液的拉曼光譜信號得到相應的結果，相比于傳統的檢測 固相基底的方法，溶液中的拉曼光譜信號檢測數據更加穩定可靠且可大量重復；
[0036] (4)本發明利用磁場物理作用分離磁性結合物與上清液，相比于傳統的清洗固相 基底來去除殘留物的步驟，此方法更加簡便、高效；
[0037] (5)本發明得到了一個寬的檢測區間（1~10000pg/mL)和低的檢測限（lpg/mL);
[0038] (6)本發明操作簡單，免疫光譜標記處理的貴金屬微粒與修飾CAP抗體的磁性微 粒溶液都可以提前準備好，操作時只需將待測樣品與免疫光譜標記處理的貴金屬溶液一起 加入到磁性微粒溶液中反應，反應結束后可以馬上進行檢測，這可以滿足環境監測部門的 要求，具有廣泛的實用性。
【附圖說明】
[0039] 圖1為實施例1中快速定量檢測氯霉素的方法流程示意圖；
[0040] 圖2為實施例1中制備的粒徑約為30nm膠體金的透射電鏡圖；
[0041] 圖3為實施例1中使用不同濃度的氯霉素標準溶液得到的拉曼信號光譜圖；
[0042] 圖4為實施例1中標準溶液中氯霉素檢測的曲線圖；其中，橫坐標代表氯霉素的濃 度（橫坐標是濃度的loglO)，縱坐標代表水體中不同濃度的氯霉素的拉曼信號強度；
[0043] 圖5為實施例1中已知濃度的水體中氯霉素檢測的曲線圖；
[0044] 圖6為實施例2中未知濃度水體中的氯霉素的拉曼信號光譜圖；
[0045]圖7為實施例3中未知濃度水體中的氯霉素的拉曼信號光譜圖；
[0046] 圖8為實施例4中氯霉素特異性檢測的拉曼信號強度圖。
【具體實施方式】
[0047] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 于此。
[0048] 下面實施例中，未注明具體條件和環境的實驗方法，通常按照常規條件，或制造廠 商所建議的條件。本發明中DP為拉曼信號示蹤分子4, 4'-聯吡啶；BSA為牛血清白蛋白； CAP為氯霉素；CAP-BSA表示CAP與BSA的偶聯物；BB表示硼酸鹽緩沖液；PBS表示磷酸鹽 緩沖液；EDC表示1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；NHS表示N-羥基琥珀酰 亞胺。
[0049] 實施例1
[0050] 如圖1所示，本實施例提供的水體中氯霉素CAP的定量檢測方法，包括以下步驟：
[0051] (1)貴金屬微粒的制備
[0052] 在不斷攪拌下將100mLImM的氯金酸（HAu