生物素酶酶活性的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種酶活性的檢測方法，具體涉及一種生物素酶酶活性的檢測方法， 屬于生物醫藥檢測領域。
【背景技術】
[0002] 生物素（Biotin)又稱為維生素B7、維生素H、輔酶R，是一種水溶性的含硫維生 素。生物素是體內4種羧化酶的輔酶，包括糖代謝中的關鍵酶丙酮酸羧化酶、催化脂肪酸 合成第一步反應的乙酰輔酶A羧化酶、在蛋白質代謝中起重要作用的丙酰輔酶A羧化酶和 β-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶。生物素的缺乏將導致上述酶活性缺失，引起體內糖、脂及蛋 白質三大營養物質代謝異常，出現線粒體能量合成障礙，引起代謝性酸中毒、有機酸尿癥及 一系列神經與皮膚系統損害，嚴重時致死。另外，生物素還是組蛋白的重要修飾成分，參與 基因表達與DNA修復等過程。
[0003] 生物素酶是一種糖蛋白，廣泛存在于血清、白細胞、成纖維細胞及肝臟等組織中。 生物素酶的主要功能是水解食物中及機體代謝產生的生物胞素和生物素-肽，產生游離的 生物素。雖然生物素在食物中廣泛存在，但絕大部分是以蛋白結合態存在，因此，生物素酶 缺陷將導致機體既無法從食物中攝取生物素又無法再生機體代謝產生的生物素，最終使機 體缺乏生物素，引起體內糖、脂及蛋白質代謝異常，即出現生物素酶缺乏癥（Biotinidase deficiency，BD)，也稱遲發型多羧化酶缺乏癥。
[0004] 生物素酶缺乏癥是一種常染色體隱性遺傳疾病，發病年齡一般在1周至10歲，平 均年齡3. 5個月，但也有幾年后仍無明顯癥狀的。生物素酶缺乏癥臨床表現復雜，涉及神經 系統、呼吸系統、皮膚系統，出現發育滯后、視力及聽力下降等，患者間癥狀差異較大；生化 異常包括代謝性酸中毒、有機酸尿癥及高氨血癥等，嚴重時出現昏迷甚至死亡。根據血漿殘 余生物素酶活性大小，可將生物素酶缺乏癥分成兩種類型，即嚴重缺乏型（酶活性〈10%正 常人平均值）和部分缺乏型（酶活性處于正常人平均值的10%~30% )。據1991年的統 計，生物素酶缺乏癥的全球發病率約為1/60, 000,但不同地區間發病率差異很大，例如希臘 高達1/4, 508、土耳其為1/11，000、歐洲10個國家的整體發病率為1/47, 486。在我國尚無 發病率統計，僅有約20例臨床病例報道，根據病例分布推測，本病在我國的發病率可能存 在南北差異。口服游離生物素可以改善或阻止生物素酶缺乏癥的臨床癥狀，療效顯著且無 毒副作用。若能及時確診患者，并終生補充生物素進行預防治療，患者將正常生長發育而不 受任何影響，但若診斷較晚，出現發育滯后、視力及聽力等器質性損傷時，這些癥狀將無法 恢復。因此，早期確診并進行預防治療，是防治生物素酶缺乏癥的關鍵。
[0005] 由于生物素酶缺乏癥臨床表現復雜多樣，且與許多其它疾病在臨床表現上有很多 相似之處（如皮疹等），容易被誤診；另外，部分缺乏型患者往往只在受壓（如感染等）情 況下才表現出癥狀，因此不易發現，但他們始終存在發病風險。若未得到正確及時的診治， 致病及致死率均較高。因此，建立生物素酶缺乏癥的診斷方法，對患者做出早期診斷，對改 善生物素酶缺乏癥患者生存質量、提高我國人口出生素質具有重要意義。
[0006] 生物素酶缺乏癥可從3個方面進行分析診斷，即生物素酶酶活性分析、體內代謝 物水平分析及基因分析，但后兩者只能作為生物素酶缺乏癥診斷的輔助或確證手段。因為 基于代謝物水平很難將生物素酶缺乏癥與其它疾病進行區分（如全羧化酶合成酶缺乏癥 等），而且代謝物水平常受到發病狀態、飲食及用藥等影響，因此基于代謝物水平分析的串 聯質譜技術等方法只能作為生物素酶缺乏癥輔助診斷措施。對于基因水平的分析，由于存 在單核苷酸多態性等原因，常常給基因分析帶來不確定性；另一方面，基因的表達翻譯及功 能的實現往往需要一些其它分子或蛋白的參與或修飾，有很多這類機制目前還未完全被揭 示，因此基因分析也不能作為診斷的可靠依據，只適用于對生物素酶缺乏癥的確證及分型。 而酶活性水平分析則基本不存在上述問題，不僅特異性高，而且不受發病狀態等影響，因 此，對生物素酶缺乏癥的診斷主要是基于生物素酶的酶活性分析，是生物素酶缺乏癥診斷 的金標準。
[0007] 目前，國際上采用的生物素酶活性分析方法多以人工底物類似物N-生物素-P-氨 基苯甲酸為反應底物，通過檢測其酶促水解產物P-氨基苯甲酸的衍生物的吸光值來檢測 酶活性，此方法較經濟，但磺胺類藥物會使檢測結果出現假陰性。另外一種可用于生物素酶 活性篩查的反應底物為生物素-6-氨基喹啉，同樣是一種人工底物類似物，通過檢測其酶 促水解產物氨基喹啉的熒光值來檢測酶活性，該方法成本較高，且可因較高的白蛋白濃度 及使用某些抗生素而出現假陽性，另外，高甘油三酯濃度會使結果出現假陰性。其它方法還 有以熒光及放射性標記的生物素衍生物等為底物的，但均存在費用較高、操作更復雜、更費 時等問題。值得注意的是，上述方法中均是以人工底物類似物作為反應底物，Ebrahim等研 究發現，以天然底物生物胞素為反應底物時，酶活性較人工底物高30±5%。因此，以生物胞 素為底物時，檢測方法具有更高的檢測靈敏度及更寬的檢測限，且更能反映樣本中生物素 酶活性的真實水平。
[0008] 但是，Ebrahim等建立的方法只能用于血清樣本的檢測，樣本用量大，酶活性穩定 時間短，且檢測前還必須對樣本進行透析處理，操作復雜。以上的不足導致該方法無法應用 于新生兒篩查，但如前所述，生物素酶缺乏癥必需得到及時的診治，否則將出現不可逆的損 傷。
【發明內容】
[0009] 本發明的目的是提供一種檢測生物素酶（Biotinidase，EC3. 5. 1. 12)酶活性的 方法，本發明的檢測方法，是以生物胞素為底物，因此具有較高的檢測靈敏度及更寬的檢測 限；并且不需要對樣本進行任何形式的前期處理，可直接用于酶活性檢測，方便快捷；可在 半自動或全自動的熒光光度計或酶標儀等熒光檢測設備上使用本發明，比較方便。
[0010] 本發明提供的酶活性的檢測方法，包括如下步驟：
[0011] 1)將樣本加入至試劑1中進行反應；反應結束后加入試劑2進行終止反應；將所 述反應后的體系進行離心分離，向得到的上清液中加入試劑3進行中和至pH值為7~11 ; 向所述中和后的體系中加入試劑4進行衍生反應；檢測所述衍生反應后的體系在激發波長 300~500nm和發射波長400~600nm下的焚光值；
[0012] 2)將經滅活處理后的樣本加入至所述試劑1中進行反應；反應結束后加入所述試 劑2進行終止反應；將所述反應后的體系進行離心分離，向得到的上清液中加入所述試劑3 進行中和至pH值為7~11 ;向所述中和后的體系中加入所述試劑4進行衍生反應；檢測所 述衍生反應后的體系在激發波長300~500nm和發射波長400~600nm下的焚光值，作為 空白對照的熒光值；
[0013] 所述反應與步驟1)中所述反應的條件相同；
[0014] 所述終止反應與步驟1)中所述終止反應的條件相同；
[0015] 所述衍生反應與步驟1)中所述衍生反應的條件相同；
[0016] 3)將至少8種不同濃度的賴氨酸標準品分別與所述試劑4進行所述衍生反應，并 檢測所述衍生反應后的體系在激發波長300~500nm和發射波長400~600nm下的焚光值； 以賴氨酸的濃度為橫坐標，以熒光值為縱坐標，制作標準曲線；
[0017] 所述衍生反應與步驟1)中所述衍生反應的條件相同；
[0018] 4)根據步驟1)中所檢測的熒光值與步驟2)中作為空白對照的熒光值的差值和所 述標準曲線，即得到步驟1)中進行所述衍生反應的賴氨酸的濃度，進而得到所述樣本中生 物素酶的酶活性；
[0019] 所述酶活性的單位定義為：以每L樣本每小時水解所述生物胞素生成的賴氨酸的 微摩爾數，表示為ymol/L/h;
[0020] 所述試劑1為由緩沖液1、酶活穩定劑和生物胞素組成的緩沖體系，所述試劑1的 pH值為3~11 ;
[0021] 所述試劑2為終止液；
[0022] 所述試劑3為中和液；
[0023] 所述試劑4為由緩沖液2和衍生底物組成的體系，所述衍生底物為1，2-二乙酰 苯、茚三酮、熒光胺和鄰苯二醛中任一種。
[0024] 上述的檢測方法中，所述試劑1中，所述緩沖液1的摩爾濃度可為50~500mmol/ L，所述酶活穩定劑的摩爾濃度可為1~50mmol/L，所述生物胞素的摩爾濃度可為0. 05~ 2mmol/L；
[0025] 所述試劑2中，所述終止液的質量百分含量可為30%~70% ;
[0026] 所述試劑3中，所述中和液的摩爾濃度可為0. 2~2mol/L;
[0027] 所述試劑4中，所述緩沖液2的摩爾濃度可為50~500mmol/L，所述衍生底物的質 量百分含量可為0. 05%~5%。
[0028] 上述的檢測方法中，所述試劑1中，所述緩沖液1的摩爾濃度可為200mmol/L，所述 酶活穩定劑的摩爾濃度可為10mm〇l/L，所述生物胞素的摩爾濃度可為2mmol/L;
[0029] 所述試劑1的pH值可為5. 5 ;
[0030] 所述試劑2中，所述終止液的質量百分含