骨質疏松血清代謝標記物的測定方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及絕經前后婦女骨質疏松血清中代謝標記物的測定方法及應用。具體涉 及采用氣相色譜聯用技術測定人血清中的代謝小分子物質，分析絕經前正常組（I組）及骨 量減少組（II組）、骨質疏松患者組（III組）和絕經后正常（IV組）血清之間的差異代謝 物譜，尋找與骨質疏松病理進程相關的差異代謝化合物，為骨質疏松早期及診斷提供技術 支持。
【背景技術】
[0002] 骨質疏松是一種以骨量減少，骨組織微結構發生破壞，骨脆性增加，骨折發生率增 加的代謝性骨病變。絕經后骨質疏松癥是絕經后婦女的高發病癥，為多因素性疾病：雌激素 的缺乏、遺傳因素、營養狀況、生活習慣、體格鍛煉、月經周期紊亂、絕經早于40歲等均與發 病有關，但絕經后雌激素缺乏則是絕經后骨質疏松癥發生的重要原因。在絕經后的婦女，第 一個5~7年中骨的丟失以每年1 %~5%的速度遞增。
[0003] 目前，通過雙能X線吸收技術對骨密度進行測定是骨質疏松早期發現和診斷的黃 金標準，此外還可通過對骨代謝生化指標，如BAP，0C，Tracp5b，PINP，NTX，CTX等進行測定 來反映骨代謝情況。骨密度檢測可以在正常、較低以及骨質疏松情況下推測骨密度，并預測 某些骨折發生的風險。然而骨質疏松發生過程中是非常緩慢的，短時間內變化不明顯，需要 長時間的觀察和連續的檢測，并且一旦發現骨質流失，骨密度降低則難以逆轉，給臨床病人 的早期診斷帶來極大的困難。
[0004] 代謝組學作為一門新興熱門的組學技術已在全球范圍內引起了廣泛的關注。目 前，代謝組學在疾病的生物標志物的篩選、早期的診斷等方面已經發揮了重要的作用。通過 對機體內源性小分子物質的檢測，代謝組學可以直觀反映不同病理狀態下的代謝物變化， 為骨質疏松早期診斷及預防提供一種有力的技術支持，可為骨質疏松早期患者予以警示， 一旦出現骨質疏松傾向，便可結合具體的骨質疏松診斷技術進行骨密度測定，以達到預防 的作用。GC-MS技術靈敏度高，可同時檢測幾百個化學性質不同的化合物，包括有機酸，氨基 酸，糖，糖醇，芳胺和部分脂肪酸等小分子代謝物。
[0005] 本發明采用GC-MS技術對正常和處于不同病理階段的骨質疏松患者血清進行檢 測，實驗設計中考慮到雌激素對骨質疏松病理進程的影響，旨在發現與骨質疏松發展進程 關聯度高的血清差異代謝物，為骨質疏松早期及診斷提供技術支持。
【發明內容】
[0006] 本發明需要解決的技術問題是，通過GC-MS檢測技術對血清生物樣本進行檢測， 采集圖譜，將樣本代謝物信息轉化為可視多維矩陣，并通過對數據建模，鑒定不同病理組血 清中差異化合物，而后對鑒定出的差異內源性代謝物與骨密度進行關聯性分析，并進行R0C 曲線分析，從而全面的反應隨著骨量的逐漸減少血清中的代謝物變化情況。
[0007] 本發明公開了一種骨質疏松血清代謝物的測定方法，采集不同病理組的血漿，離 心得到血清樣本，加入3倍體積的含內標甲醇（內標：d27肉豆蔻，10 μ g/mL)提取，旋轉蒸 發儀揮干后進行肟化和硅烷化處理，進GC-MC檢測。再對數據的采集和處理，對不同病理組 血清中內源性小分子代謝物質進行PCA和PLS-DA計算，尋找不同病理組間的差異化合物。 具體步驟如下：
[0008] (1)收集血清樣本，樣本數量不少于382 ;
[0009] (2)將提供血清樣本的病人按照骨質疏松進程分為絕經前正常組（I組）及骨量減 少組（II組）、骨質疏松患者組（III組）和絕經后正常（IV組）；
[0010] (3)采用GC-MS聯用技術對血清樣本進行分析；
[0011] (4)應用SnCAP-ll軟件建立多維統計模型，尋找實驗組別間的代謝差異化合物 譜，所述代謝差異化合物為骨質疏松病理進程中血清代謝標記物；
[0012] (5)采用關聯分析及R0C曲線分析進一步確定與骨質疏松病理進程相關性較高的 差異代謝物。
[0013] 本方法步驟（2)中根據骨質疏松的病理進程分組，分組考慮到激素的缺失與否以 及骨量缺失程度。
[0014] 本方法步驟（3)中GC-MS分析條件如下：
[0015] 色譜條件：色譜柱為石英毛細管柱Agilent 19091S-433,325 °C， 30m*250 μηι*0. 25 μπι，進樣量1 μ 1，采用不分流進樣模式，載氣為氦氣，流速為lml/min，程 序升溫模式：70°C保持2min，以10°C /min線性升溫至300°C，300°C保持7min ;
[0016] 質譜條件：進樣口溫度為250°C，傳輸管溫度250°C，離子源溫度為150°C，采用全 掃描模式，離子掃描范圍為50~550,掃描速度是2. 91spectra/s，有300s的溶劑延遲，檢 測電壓是-1650V ;
[0017] 本方法步驟（4)采用smcAP-ii軟件對數據進行建模處理，尋找潛在差異代謝物， 步驟（5)采用關聯分析及R0C曲線分析進一步確證所發現的血清代謝標記物與骨質疏松病 理進程的相關性及預測的準確性。
[0018] 本方法步驟（5)中所述的骨質疏松血清差異代謝物有脂肪酸類化合物，包括油 酸、亞油酸、花生四烯酸、cis-11，14-二十碳二烯酸等，色氨酸和肌醇。
[0019] 本發明的有益效果是：
[0020] 本方法測定與骨質疏松病理進程有關的血清差異代謝物來體現患者骨質疏松程 度，并考慮到激素對骨質疏松病理進程的影響，測定方法簡單，靈敏度高，對病人傷害小，可 為臨床骨質疏松早期診斷及預防提供幫助和依據，對處于骨質疏松早期、大多生理生化指 標尚不明確階段的患者予以警示。
【附圖說明】
[0021] 圖1為全掃描模式下樣本的總離子流圖（橫坐標一保留時間，縱坐標一峰強）。
[0022] 圖2為四組樣本的PLS-DA得分圖；A :絕經前骨量正常組與絕經后骨量減少組， R2X = 0. 235, R2Y = 0. 638, Q2= 0. 337 ;B :絕經前骨量正常組與絕經后骨質疏松組，R2X = 0. 298, R2Y = 0. 664, Q2= 0. 462 ;C :絕經前骨量正常組與絕經后骨量正常組，R 2X = 0. 254， R2Y = 0. 618, Q2= 0. 375。黑色方塊：絕經前正常組；黑色三角：絕經后骨量減少組；黑色星 形：絕經后骨質疏松患者；圓圈：絕經后骨量正常組。
[0023] 圖3為血清中差異代謝物的ROC曲線分析圖；A :絕經前骨量正常組與絕經后骨量 減少組；B :絕經前骨量正常組與絕經后骨質疏松組；C :絕經前骨量正常組與絕經后骨量正 常組。
【具體實施方式】
[0024] 通過實施例對本發明進行詳細描述。
[0025] (1)收集樣品
[0026] 參照世界衛生組織（WHO)推薦的診斷標準，骨密度值降低1~2. 5個標準差為骨 量減少組，降低等于及大于2. 5個標準差為骨質疏松組。基于以上標準，收集50~70歲年 齡段絕經前骨量正常及絕經后骨量正常、骨量減少和骨質疏松四個實驗組血樣。樣本收集 過程中，排除標準如下：
[0027] a):已知影響鈣或骨代謝疾病患者，如嚴重吸收不良綜合征、炎癥性腸炎、慢性肝 病、酒精性肝硬化、未得到有效控制的原發性甲狀旁腺功能亢進者或甲狀腺疾病、Paget' s 骨病、骨軟化病等
[0028] b):繼發性骨質疏松癥、類風濕性關節炎、痛風、多發性骨髓瘤等；
[0029] c):嚴重心、肝（AST〉正常上限的2倍）、腎疾病（血清肌酐濃度>177 μmol/L)
[0030] d):糖尿病患者（HbAlc>7. 7% )
[0031 ] e) : 1年內應用糖皮質激素（包括全身、外用、關節內、吸入），雄激素，二膦酸鹽，降 鈣素，含鈣或鋁的抗酸劑，氟化物（不包括氟化水和局部牙科治療），雌激素，黃酮體，香豆 素累，肝素，抗驚厥藥（苯二氮卓類除外）以及其他影響骨代謝的藥物超過3個月；
[0032] f):近3年有不良嗜好，如偏食，酗酒，吸煙，長期飲用咖啡因飲料。
[0033] (2)樣品處理
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