一種吡咯并喹啉醌pqq二鈉鹽雜質的分離純化方法
【技術領域】
[0001] -種吡咯并喹啉醌PQQ二鈉鹽雜質的分離純化方法，屬于化學藥物雜質研究的技 術領域。
【背景技術】
[0002] 近年來，由于環境等因素的影響，化學性肝損傷越來越多。而化學性肝損傷極易發 展為肝硬化。目前在國際上尚未有明確的治療藥物，因此，急需安全有效的化學性肝損傷防 治藥物。
[0003] PQQ(吡略并喹啉醌，pyrroloquinolinequinone)是多種氧化還原酶的輔基，廣泛 存在于動植物體內，因具有強大的清除自由基功能而在體內發揮重要作用。它能有效預防 和治療四氯化碳引起的肝損傷，對酒精性脂肪肝的預防和治療具有顯著作用，有望成為新 型的肝損傷防治藥物，具有良好的臨床應用前景。
[0004] PQQ可以通過生物生產方法進行制備，但生物法生產及分離純化困難且成本奇高。 本公司經過優化工藝路線和工藝條件，通過化學合成的方法直接制備得到水溶性更好的 PQQ二鈉鹽。
[0005] 藥品在臨床使用中會產生一些不良反應，這個不良反應除了與藥品本身的藥理活 性有關外，與藥品中存在的雜質也有很大的關系。因此，對于化學藥品各個國家藥典均在附 錄中設有專門的雜質檢查通則，中國藥典（ChP)二部從（2005)開始附錄中設有藥物雜質研 究指導原則，國家食品藥品監督管理局也發布了《化學藥物雜質研究的技術指導原則》。針 對藥品中的雜質，必須依據其生理活性制定其質控限度，其中包括：藥品中的雜質被有效的 分離，從而保證藥品質量，減少藥物的不良反應。
[0006] 雜質的分離制備是藥物研究中最為關鍵的技術之一。由于PQQ分子結構的特殊 性，在化學合成中易引入類似結構副產物，由于其化學結構的相似性，傳統的分離方法如萃 取、重結晶、蒸餾和TLC都很難將其分離。分析型的HPLC只能獲得μg級的產物，為了獲得 高純度的PQQ二鈉鹽，需提取其主要雜質并進行結構確證。我們首次采用制備高效液相色 譜經過優化制備分離條件、優化分析條件、考察上樣載量；后處理中，由于PQQ結構的復雜 性，普通的有機溶劑體系很難將其與雜質分離，由于流動相采用了特殊的試劑，使后處理也 非常困難。我們通過考察樣品的穩定性，如耐高溫，所加鹽濃度、所調pH值、并嘗試用冷藏 洗出辦法，最終將PQQ合成副產物雜質有效分離，制備獲得l〇〇mg的雜質產物，并采用高分 辨質譜（HRMS)、紅外吸收光譜（IR)、核磁共振譜（NMR)對雜質的化學結構式進行確證，最終 確證其分子式及化學結構和化學名稱，為申報PQQ臨床用藥制定雜質限量提供可靠依據。 相關研究國內外未見報道。
【發明內容】
[0007] 本發明目的是提供一種吡咯并喹啉醌PQQ二鈉鹽雜質的分離純化方法，最終將 PQQ合成副產物雜質有效分離，制備獲得l〇〇mg的雜質產物，并采用高分辨質譜（HRMS)、紅 外吸收光譜（IR)、核磁共振譜（NMR)對雜質的化學結構式進行確證，最終確證其分子式及 化學結構和化學名稱，為申報PQQ臨床用藥制定雜質限量提供可靠依據。
[0008] 本發明的技術方案：一種吡咯并喹啉醌PQQ二鈉鹽雜質的分離純化方法，步驟為： (1) PQQ溶解性的考察：在含10%四丁基氫氧化銨的0. 04M磷酸二氫銨緩沖溶液（pH 7. 0)作溶劑時PQQ溶解度達到10mg/mL，滿足制備HPLC上樣的要求； (2) 優化制備分離條件 選擇四丁基氫氧化銨作為離子對試劑，選用〇. 04M磷酸二氫銨作緩沖體系； 色譜柱的選擇：選擇GPC18型號的色譜柱； 流動相配比的優化： 流動相A:Buffer的配制：稱取12. 974g的10%四丁基氫氧化銨水溶液，4. 6g磷酸二 氫銨，加水至1L，用磷酸調至pH7. 0 ;用0. 45μm濾膜過濾； 流動相B:乙腈ACN; 流動相A/流動相B的體積比為80/20~70/30之間主峰與雜質分離較好，而且雜質峰 對稱性較好； pH值的影響：選擇pH7.0 ; (3) 制備柱上的分離 上樣液的配制：以流動相A為溶解溶液，配制10mg/mL的PQQ溶液，0. 45μm濾膜過濾； 選擇柱子：GPC18 :5μπι，21· 2X250mm; 流動相采用：Buffer:ACN= 80 ~70 : 20 ~30,v/v; 柱溫:室溫； 流速：20mL/min; 進樣體積：10mL; 壓力：1756psi; 檢測波長：225nm; (4) 收集的雜質純度鑒定 a、 收集液的處理 濃縮：將制備柱得到的收集液在60°C下旋轉濃縮5倍，得濃縮液； 鹽析：在濃縮液中加入1. 5M的氯化鈉溶液，使收集的餾分溶液中最終的氯化鈉濃度達 至IJ0. 8-1. 0M，用HC1調至pH2. 0 ;將上述溶液在4°C下靜置48h; 過濾：用0. 45μm濾膜過濾鹽析液，將沉淀濾出，再次用去離子水洗滌沉淀2次； 干燥：將帶沉淀的濾膜置于40°C下真空干燥24h; 將樣品從濾膜上刮下，置于樣品瓶中，稱重；包裝； b、 樣品純度鑒定 分析柱：GPC18 :5μπι，4· 6X250mm; 流動相：Buffer:ACN體積比70 : 30; 柱溫:室溫； 流速：1mL/min; 進樣體積：20μL; 檢測波長：225nm; 分析過程中出峰時間略有漂移，采用內標法確認了所制備產物為目標雜質，所制備產 物的純度大于95% ; (5)雜質結構鑒定 所收集的雜質組分采用質譜MS/高分辨質譜HRMS、紅外吸收光譜IR、核磁共振譜NMR對PQQ雜質進行分析，最后確證其分子式及化學結構和化學名稱，即本雜質的分子式為 C14H3N20sClNa2，化學名稱為3-氯-1H-吡咯[2, 3-f]P奎啉-2, 7, 9-三羧酸-二鈉鹽。
[0009] 本發明的有益效果：本發明將PQQ合成副產物雜質有效分離，制備獲得100mg的 雜質產物，并采用高分辨質譜（HRMS)、紅外吸收光譜（IR)、核磁共振譜（NMR)對雜質的化學 結構式進行確證，最終確證其分子式及化學結構和化學名稱，為申報PQQ臨床用藥制定雜 質限量提供可靠依據。
【附圖說明】
[0010]圖 1 分析柱高效液相色譜圖（GPC18 (5μL?，4. 6X250mm，Buffer/ACN在 80/20，lmg/mLPQQ，進樣體積：10yL，流速：1mL/min，檢測波長：225nm) 圖2制備高效液相色譜圖，（GPC18 (5μπι，21.2X250mm)，0. 04M磷酸二氫銨緩沖 溶液含 10% 四丁基氫氧化銨（pH7.0) :ACN= 75 : 25 (v/v)，10mg/mLPQQ，流速：20 mL/min，進樣體積：10mL，檢測波長：225nm) 圖3?00雜質純度鑒定色譜圖，間（：18(54111，4.6\250臟），流動相：含10%四丁基 氫氧化銨的0.04M磷酸二氫銨緩沖溶液：ACN= 70 : 30 (V/v)，lmg/mLPQQ雜質，流速： 1mL/min，進樣體積：20yL，檢測波長：225nm] 圖4PQQ雜質紅外光譜圖 圖5PQQ雜質質譜圖 圖6PQQ雜質核磁氫譜圖 圖7PQQ雜質核磁碳譜圖。
【具體實施方式】
[0011] 實施例1.樣品溶解性的考察 由于制備型液相色譜要求進樣量大，樣品濃度過低引起進樣體積太大，高濃度的溶質 超載，在分離過程中可以避免大體積引起的峰的擴張。因此，必須找到合適的溶劑達到一定 的溶解度才能在制備色譜柱上有效分離，并獲得一定的制備量。
[0012] 分別用去離子水、甲醇、乙腈（CAN)、含10%四丁基氫氧化銨的0. 04M磷酸二氫銨緩 沖溶液（pH7.0)(Buffer)，Buffer/ACN(7:3)、考察PQQ在不同溶劑中的溶解度。結果見 下表：
在含10%四丁基氫氧化銨的0. 04M磷酸二氫銨緩沖溶液（pH7. 0)作溶劑時，PQQ溶解 度達到10mg/mL，滿足制備HPLC上樣的要求。
[0013] 實施例2.優化制備分離條件 化學合成中的制備色譜條件一般選擇參考分析柱色譜條件，再擴大到同類型的制備柱 分離。對未知樣品的提取和純化，通常采用分析柱探索分離條件，然后按規模放大分離。一 般情況下，制備色譜的分離度應該大于1. 25,根據制備規模選擇制備色譜柱、放大進樣量、 流速等，最后在制備色譜中再進行適當調整。
[0014] 制備色譜是在非線性范圍內運行，屬于非線性色譜，分析色譜是線性色譜。因此許 多用于分析型液相色譜的概念或參數在制備色譜中不太適用，使用這分析色譜的一些方法 很容易引入歧途。常見問題是在制備色譜中很少考慮分離度、柱效和雜質峰型的對稱性，在 分析柱上能夠與雜質分離，但放大到制備柱上，峰會產生漂移，很難達到理想的效果。
[0015] 2. 1分析柱分離條件優化 文獻報道PQQ的分析方法有采用乙腈/水進行梯度洗脫，主峰與雜質峰不能達到有效 分離，這種體系根本無法用于雜質制備。最新分析方法采用離子對色譜乙腈-四丁基溴化 銨-磷酸二氫鉀體系能在分析柱上將PQQ與雜質有效分離，但考慮到最終我們要進行雜質 組分回收，流動相首先應使制備組分有較大的溶解度，且容易從純化后的組分中除去，最終 制備的組分必須進行質譜核磁等分析，因此流動相應盡少帶入其他離子。因此我們進行了 改進，選擇四丁基氫氧化銨（10%水溶液）(水溶性好于四丁基溴化銨，而且少引入溴離子)作 為離子對試劑，相對應的我們選用磷酸二氫銨作緩沖體系（少引入鉀離子)。在此條件下我 們在分析柱上探索最佳分離條件。與文獻方法相比，我們的目的是要制備得到雜質，因此更 要關注雜質峰的峰型和對稱性，這是一個重大的挑戰。
[0016] 2. 1. 1色譜柱的選擇 我們選擇不同基質鍵合的C18柱（SepaxHP、Amethyst_P、GP C18等)試驗。與SepaxHP、Amethyst-P柱相比，經優化鍵合的GP C18填料硅羥基表面覆蓋度更高而使色譜保留更強， 分離度更佳，雜質峰的對稱性更好。采用文獻方法的Amethyst-P柱雖然在