一種針對egfr靶向治療藥物的生物學活性檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種針對EGFR靶向治療藥物的生物學 活性檢測方法。
【背景技術】
[0002] 正常細胞的增殖是通過各自的配體激活其生長因子受體所致，比如生長因子受體 酪氨酸激酶，這個過程是嚴格控制的。腫瘤細胞的增殖也是通過生長因子受體的激活產生 的，但失去了正常增殖的嚴格控制。這種失控是由很多因素導致的，如生長因子的過度表達 或生長因子受體的過度表達，以及生長因子所調節的生物化學通道的自主激活。
[0003]表皮生長因子受體（Epithelialgrowthfactorreceptor,EGFR)家族成員是特 別重要的與表皮細胞的腫瘤化有關的生長因子受體酪氨酸激酶，它們在細胞表面與特異的 生長因子或天然配體相互作用。EGFR是一種分子量約為170KD的跨膜糖蛋白，廣泛分布于 哺乳動物上皮細胞、成纖維細胞、膠質細胞、角質細胞等細胞的表面，其信號通路在細胞的 生長、增殖和分化等生理過程中發揮著重要的作用。研究表明，EGFR與腫瘤細胞的增殖、血 管生成、腫瘤侵襲、轉移及細胞凋亡的抑制有關，在許多實體腫瘤中都存在EGFR的高表達 或異常表達。由于EGFR在腫瘤細胞生長、分化中起著重要的作用，EGFR已經成為具有良好 前景的腫瘤治療靶點。
[0004]在藥物的研制過程中，生物學活性檢測方法是藥物篩選以及質量控制的重要評價 參數，該方法必須通過方法驗證，滿足專屬性、精密度、準確度等方法驗證方面的要求，這樣 才能保證生物學活性檢測結果的可靠性，才能用于指導藥物的篩選以及質量控制。
[0005]目前常用的針對EGFR靶向治療藥物的生物學活性測定方法，是依據藥物對細胞 具有增殖抑制作用的原理進行實驗設計的，使用的細胞系主要是DiFi細胞和MDA-MB-468 細胞，從文獻報道來看，該增殖抑制的細胞學活性方法并未得到公認或標準化，如DiFi細 胞尚無公認的標準化細胞株，不能通過ATCC或者中國細胞保藏中心的細胞庫進行購買并 建庫，MDA-MA-468細胞對于藥物的靈敏度要欠缺一些，如文獻報道，對于一些高親和力的抗 EGFR單克隆抗體，藥物最高使用濃度要達到50-200ug/ml，顯色方式和顯色條件也各不相 同。更重要的是，在已經報道的針對EGFR靶向治療藥物的生物學活性檢測方法中，缺乏對 檢測體系專屬性、精密度、準確度等方面的方法驗證與評價，難以確保檢測結果的準確性與 可靠性。
【發明內容】
[0006]本發明的發明人針對現有EGFR靶向治療藥物的生物學活性測定方法存在的問題 與不足，研究了一種能夠簡便、準確、高效地評價EGFR靶向治療藥物的生物學活性檢測方 法，該方法能夠滿足方法驗證過程中對專屬性、準確度、精密度（包括重復性、日間差、人員 操作誤差）等方面的要求，該方法對于EGFR靶向治療藥物的研究開發，質量控制乃至臨床 應用都具有重要的意義。
[0007] 具體地，本發明公開了一種評價EGFR靶向治療藥物的生物學活性檢測方法，包括 下列步驟：
[0008] (1)細胞鋪板：取對數生長期高表達EGFR的細胞制成細胞懸液，分別加入細胞培 養板孔中，然后將細胞培養板置于培養箱中培養，使細胞貼壁；
[0009] (2)參考品及供試品稀釋：取參考品及供試品，根據標示濃度，先預稀釋至一定濃 度，再進行系列梯度稀釋；
[0010] (3)加樣：將步驟（2)稀釋好的系列梯度濃度的參考品及供試品依次加入步驟（1) 中的細胞培養板孔中，然后將細胞培養板置于培養箱中培養；
[0011] (4)顯色：采用檢測活細胞或死細胞量的檢測體系對細胞培養板進行顯色反應；
[0012] (5)測定分析：步驟4顯色反應完成后，取出細胞培養板混勻，放入酶標儀，對顯色 反應結果進行測定，并根據測定結果計算供試品的細胞增殖抑制生物學活性。
[0013] 在一些實施例中，優選地，步驟⑴所述高表達EGFR的細胞是人表皮癌細胞 A-431。
[0014] 更優選地，上述步驟（1)所述的細胞鋪板，是取對數生長期高表達EGFR的細胞經 胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，計數并調整至合適的細胞密度，以1〇〇μ1/孔加入96孔細 胞培養板中，然后將細胞培養板置于37°C，5 %二氧化碳培養箱中培養過夜，使細胞貼壁。更 優選地，上述步驟（2)所述取參考品及供試品，是根據標示濃度，先預稀釋至一定濃度，再 進行系列梯度稀釋，優選的系列梯度為7-11個稀釋度。更優選地，上述步驟（3)所述加樣， 是將稀釋好的系列梯度濃度的參考品及供試品以1〇〇μ1/孔依次加入步驟（1)所述的細胞 培養板中，然后將細胞培養板放置于37°C，5%二氧化碳培養箱中培養68-74小時。更優選 地，上述步驟（5)所述供試品細胞增殖抑制生物學活性是通過以下方法獲得，用參考品孔 和供試品孔測定值與加樣濃度的量效關系進行4參數擬合，確定參考品與供試品的EC5。值， 曲線擬合常數R2,并按照下列公式計算供試品的細胞增殖抑制生物學活性：
[0015]
[0016] 在一些實施例中，優選地，上述任一所述EGFR靶向治療藥物是單克隆抗體、融合 蛋白、激酶抑制劑、反義寡核甘酸、化合物、中藥提取物或中藥復方提取物之一或它們的任 意組合，其中優選為單克隆抗體，更優選為尼妥珠單抗、西妥昔單抗、帕尼單抗。
[0017] 在一些實施例中，優選地，上述任一所述步驟（1)所述懸液細胞密度為（3-8)X104 個 /mL〇
[0018] 在一些實施例中，優選地，上述任一所述步驟（3)所述的參考品溶液和供試品溶 液濃度預稀釋至〇. 5-20ug/mL;更優選地，所述的系列梯度稀釋是1. 5-2倍系列梯度稀釋。
[0019] 在一些實施例中,優選地，上述任一所述步驟（4)中,所述檢測活細胞或死細胞量 的檢測體系為包括但不限于：四唑類化合物氧化還原檢測體系、ATP總量檢測體系、LDH釋 放量檢測體系等。更優選地，所述四唑類化合物為MTT、MTS、CCK-8等等，最優選為CCK-8， 因為相對于MTT和MTS而言，CCK-8所形成的還原顯色物質可直接溶于水相，無需添加DMS0 助溶，因此使用更加方便，檢測靈敏度也較高。
[0020] 本發明采用的體外細胞增殖抑制法評價EGFR靶向治療藥物的生物學活性，該方 法專屬性好，特異性強，準確度高，測定范圍達到50-150%;精密度高，重復性、日間差以及 人員操作誤差RSD均小于20%，參考品和供試品的4參數擬合曲線的擬合常數R2均大于 0.95。因此，采用本發明提供的方法能夠簡便，準確，高效地評價EGFR靶向治療藥物的生 物學活性，這對于EGFR靶向治療藥物的研究開發，質量控制乃至臨床應用都具有重要的意 義。
【附圖說明】
[0021] 圖1抗EGFR單克隆抗體藥物參考品和供試品的生物學活性4參數曲線擬合圖（A: 最大吸光值，B:斜率；C;EC5。值；D:最小吸光值；R~2:曲線擬合常數）；
[0022] 圖2抗EGFR單克隆抗體和陰性對照的生物學活性4參數曲線擬合圖（A:最大吸 光值，B:斜率；C;EC5。值；D:最小吸光值；R~2:曲線擬合常數）；
[0023] 圖3MTS顯色法的抗EGFR單克隆抗體藥物參考品的生物學活性4參數曲線擬合圖 (A:最大吸光值，B:斜率；C;EC5。值；D:最小吸光值；R~2:曲線擬合常數）；
[0024] 圖4基于MDA-MB-468細胞的抗EGFR單克隆抗體藥物參考品和供試品生物學活 性4參數曲線擬合圖（A:最大吸光值，B:斜率；C;EC5。值；D:最小吸光值；R~2:曲線擬合常 數）。
【具體實施方式】
[0025] 以下結合具體實施例對本發明進一步闡述，不應理解為是對本發明的限制。下列 實施例中未注明具體條件的實驗方法，均是按照常規條件或制造廠商所建議的條件；除非 另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語均是指本領域普通技術人員所熟悉的含義， 例如，EC5。（指半數有效濃度）、0D(指吸光值）、CV(指變異系數）、RSD(指相對標準偏差）、 SD(指標準偏差）等等。
[0026] 下列實施例涉及到的材料和試劑，實驗條件和方法如下：
[0027] 一、材料和試劑
[0028] 材料：EGFR靶向治療單克隆抗體藥物參考品（上海抗體藥物國家工程研究中心有 限公司提供），EGFR靶向治療單克隆抗體藥物供試品（上海抗體藥物國家工程研究中心有 限公司提供）。
[0029]試劑：染色液CCK-8 (購于Dojindo)，RPMI1640培養基粉末（購于GIBC0)，鏈霉素 /青霉素雙抗（購于GIBC0)，胰蛋白酶（購于GIBC0)，FBS(購于GIBC0)。
[0030] 細胞株：A-431細胞株（購于ATCC)，MDA-MB-468細胞株（購于ATCC)。
[0031] 二、檢測方法步驟
[0032] 1、細胞鋪板：取對數生長期高表達EGFR的細胞經胰蛋白酶消化后制成細胞懸液， 計數，細胞活率應不低于85 %，調整細胞密度至（3-8)X104個/mL，以100μ1/孔加入96孔 細胞培養板中，然后將細胞培養板置于37°C，5%二氧化碳培養箱中培養過夜，使細胞貼壁。
[0033] 2、參考品及供試品稀釋：取參考品及供試品，預稀釋至0. 5_20ug/mL，再做系列梯 度稀釋，得到7-11個稀釋度。
[0034] 3、加樣：將稀釋好的系列梯度濃度的參考品及供試品以100μ1/孔依次加入上述 的細胞培養板中，然后將細胞培養板放置于37°C，5%二氧化碳培養箱中培養68-74小時。
[0035] 4、顯色：采用CCK-8進行顯色，10_20ul/孔。
[0036] 5、讀數：顯色反應完成后，取出細胞培養板混勻，放入酶標儀，對顯色反應結果進 行測定，記錄測定結果。
[0037] 6、結果分析：用參考品孔和供試品孔測定值與加樣濃度的量效關系進行4參數曲 線擬合，確定參考品與供試品的EC5。值，曲線擬合常數R2。按照下列公式計算供試品的細胞 增殖抑制生物學活性。
[0038]
[0039] 實施例1細胞增殖抑制法評價EGFR靶向治療藥物的生物學活性
[0040] 以參考品和供試品為材料，采用上述檢測方法檢測考察供試品相對參考品的生物 學活性。
[0041] 實驗結果如圖1所示，參考品及供試品4參數曲線擬合情況良好，曲線擬合常數R2 均滿足> 0. 95,復孔檢測0D值