一種檢測3D類器官中P-gp介導的Rh123轉運的方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種檢測3D類器官中p-gp介導的Rhl23 轉運的方法及其在篩選P-gp抑制劑中的應用。
【背景技術】
[0002] 目前在臨床上，口服給藥是最常見的給藥方式，而且相對于靜脈等其他的給藥方 式，具有相對安全和方便的優點。藥物進入機體內，一般要經過吸收、分布、代謝和排泄 的過程，對于口服藥物來說，其在小腸的吸收最為重要，因為這是藥物在機體內發揮藥效 的前提。有研究表明，在新藥研發過程中，大約40%的先導化合物在臨床階段被否決的 最常見原因包括了藥動學性質不理想，尤其是口服后吸收性較差，造成藥物的生物利用 度太低。因此，在化合物篩選的早期階段，不僅要關注化合物的活性，也要對其藥動學性 質進行合理的評估，以期減少后期研究的投入和降低失敗的風險。其中，基于P-糖蛋白 (P-glycoprotein,P-gp)轉運體介導的藥物篩選及藥物吸收與外排的研究在新藥研發中占 有重要的地位。
[0003]P-gp是腺苷三磷酸（ATP)依賴性藥物外排轉運體，屬于ATP結合盒（ATPbinding cassette,ABC)轉運體家族中最大的一個亞型，亦是最重要的亞型之一。1976年，Juliano 等人首次在秋水仙堿耐藥的中國倉鼠卵巢細胞中發現了高分子質量（170kD)的細胞膜糖 蛋白，并因其表達水平與細胞膜的通透性、細胞內的藥物濃度以及細胞耐藥程度有關而將 其命名為P-gp。研究發現，P-gp在小腸粘膜的上皮細胞等正常的組織和細胞中也有表 達。機體出于對自身的保護，藥物等外來的有害物質在小腸的吸收就會受到限制，這也是 造成口服藥物在體內生物利用度降低的原因之一，進而影響了藥效的發揮。因此，P-gp 在藥代動力學，特別是在藥物的吸收與外排的過程中發揮著重要的作用。另外，P-gp在 腫瘤細胞中的過度表達限制了抗腫瘤藥物的攝取，是造成腫瘤細胞多藥耐藥（Multidrug resistance,MDR)現象產生的重要原因。
[0004] 隨著技術的發展及科研的需要，多種利用體外模型來模擬人的小腸上皮，并進行 P-gp介導的藥物轉運的研究相繼被報道。其中，基于人的結腸癌細胞系（caco-2)建立的細 胞單層轉運模型是國內外應用最廣泛的模型。在轉運小室（Transwell)的碳酸聚酯膜上培 養caco-2細胞，通過細胞之間的緊密連接形成具有極性的細胞單層，可用于研究P-gp底物 的吸收與外排。雖然該模型被視為體外研究藥物轉運的標準，但是，其存在的一些局限性依 然不能被忽視。例如，caco-2腫瘤細胞在生理和形態上與正常的小腸上皮細胞有很大的差 另IJ;而且，細胞的培養條件和代數會對模型的穩定性造成影響；另外，培養周期（21天）過 長也是高通量篩選的一個制約因素。因此，非常有必要建立一種全新的體外研究P-gp介導 的藥物轉運的模型。
[0005] 2009年，Toshiro Sato等人報道了在體外利用單個小腸隱窩可以分化形成絨毛 狀的上皮結構。小腸隱窩中存在的干細胞在適宜的條件下具有分化再生功能，在基質膠中 可以形成一個三維的球狀類器官（organoid)結構，因此稱之為3D類器官。3D類器官中新 形成的隱窩向外側突起，內側形成了絨毛狀的結構，相比于caco-2細胞轉運模型，3D類器 官是由正常的小腸干細胞分化而來，因此其在生理上與小腸上皮更為相似。而且，P-gp在 3D類器官中的表達的位置與表達量與其在小腸中的表達沒有明顯差異。另外，培養周期短 (3-5天）也為P-gp介導的藥物轉運的篩選節約了時間和經濟成本。
[0006]目前，利用3D類器官模型進行p-gp介導的藥物轉運的研究已有報道。羅丹明 123 (Rhl23)作為P-gp的底物，被P-gp通過外排作用從培養基（基底側）中轉運至3D類 器官的腔中（腸腔側）。而且由于Rhl23可以自發熒光，激發波長(λΛ)為485nm，發射波長 (\m)為535nm，這也為Rhl23的檢測和定量提供了便利。雖然已有的報道通過熒光定量顯 微鏡對3D類器官中的Rhl23進行實時監測，根據熒光的強弱來反應其濃度的高低。但是該 方法每次只能對一個3D類器官進行監測，而且每次監測需要在整個實驗過程中對熒光強 度進行實時追蹤。該方法不僅過程繁瑣，而且需要耗費大量的時間。
【發明內容】
[0007] 為了克服現有技術中的上述缺陷，本發明提出了一種全新的體外研究P-gp介導 的Rhl23轉運的檢測方法。該檢測方法具有簡便、快速、靈敏度高的優點，可利用3D類器官 模型進行P-gp介導的藥物轉運的研究，也可進行P-gp抑制劑體外篩選的研究。
[0008] 具體地，本發明提出了一種檢測3D類器官中P-gp介導的Rhl23轉運的方法及應 用。所述方法包括：（1) 3D類器官分別與①P-gp的底物Rhl23②Rhl23和P-gp的抑制劑 共孵育；（2) 3D類器官的收集，超聲破碎法使其中的Rhl23釋放；(3)在多功能酶標儀上對 Rhl23的熒光強度進行檢測，進而可以得知3D類器官中Rhl23的濃度。
[0009] 所述"3D類器官模型"指的是小腸隱窩中的干細胞在基質膠中，利用含有 Responding, m-noggin和m-EGF等生長因子的Advanced DMEM/F12培養基提供必要的營養 成分，進行分化再生而形成的三維的球狀結構。所述3D類器官模型中間是由細胞圍成的一 個球狀空腔，模擬的是小腸的腸腔側；而外周的突起是由干細胞分化形成的新的隱窩，模擬 的是小腸的基底側。
[0010]所述p-gp底物包括地高辛（Digoxin)、洛哌丁胺（Loeramide)、奎尼丁 (Quinidine)、長春花堿（Vinblastine)和Rhl23 等；優選使用P-gp底物Rhl23。所述P-gp 底物Rhl23在本發明中的作用是作為一種探針，指示3D類器官中P-gp的活性。Rhl23可被 P-gp從培養基中（基底側）轉運至3D類器官的腔側（腸腔側）。在相同的轉運時間內，3D 類器官的腔側Rhl23的濃度的高低與P-gp活性呈正相關。
[0011] 所述p-gp介導的藥物指的是可與p-gp的活性位點結合，并借助ATP提供的能量 進行轉運的藥物。Rhl23作為P-gp的底物，可以與3D類器官上的P-gp結合而被轉運。如 當P-gp的活性位點被抑制劑抑制時，P-gp介導的Rhl23轉運就會受到限制，3D類器官腔側 的Rh123濃度就會降低。
[0012] 所述P-gp的抑制劑包括克拉霉素（Clarithromycin)、酮康挫（Ketoconazole)、利 托那韋（Ritonavir)、奎尼丁（Quinidine)和Verapamil等；優選地，所述P-gp抑制劑為維 拉帕米（Verapamil) 〇
[0013] 所述P-gp的抑制劑Verapamil在本發明中的作用是作為一種陽性抑制劑來驗證 所建立的方法是否正確可靠，從而保證方法可以用于P-gp抑制劑的篩選。Verapamil作用 機制是與P-gp的底物Rhl23競爭性地結合P-gp的活性位點，從而減弱P-gp對Rhl23的外 排作用，最終導致3D類器官腔側Rhl23濃度的降低。
[0014] 超聲破碎法的具體操作條件為：在400瓦特（W)的工作電壓下，超聲時間為5秒 (s)，間隙時間為2s，工作次數為3次。
[0015] 3D類器官破碎的程度為：在上述操作條件下，由細胞團狀沉淀變成混懸狀濁液 時，離心并測定上清中的Rhl23的熒光強度。
[0016] 其中，所述步驟（1)中，3D類器官培養至第三天時，對96板中各個孔的3D類器官 進行計數，然后吸掉培養基；并分別加入新的含藥培養基：對照組（Control)只含有Rhl23; 給藥組同時含有Rhl23和維拉帕米（Verapamil)，其中Rhl23的濃度為10μM，P-gp抑制劑 Verapamil的濃度為 20μM〇
[0017] 更具體地，所述步驟（1)中在3D類器官培養前包括小鼠小腸隱窩的分選：
[0018] ①取C57BL/6小鼠的小腸，將其分成若干片段，并從中間剪開，用預冷的磷酸鹽緩 沖液（Phosphatebufferedsaline，PBS)清洗干凈。用蓋玻片清除小腸絨毛，并將其轉入 含有適量PBS的離心管中，置于冰上。
[0019] ②用含青霉素/鏈霉素（P/S)的PBS清洗3-4次，再將小腸片段轉移至含有EDTA 的PBS中，于4°C冰箱消化。
[0020] ③將消化好的小腸片段轉移至離心管，加入含有P/S的PBS，用力地搖晃數次后， 收集懸浮液，用細胞過濾網過濾、離心、沉淀即為小腸的隱窩。
[0021] ④棄上清，用Advanced DMEM/F12培養基重懸沉淀，計數。（培養基中含有 Responding, m-noggin和m-EGF三種生長因子，可誘導小腸細胞的分裂及隱窩的擴增。）
[0022] ⑤取重懸液轉移至離心管中，離心。
[0023] ⑥用預冷的基質膠（Matrigel)重懸沉淀并計數，隱窩的數量控制在5-10個/μ1 為最佳（基質膠具有在22-35°C為固態，在4°C為液態的特性）。
[0024] ⑦接板：將96孔板放入細胞培養箱中預熱，向每個孔中加入重懸液。
[0025] ⑧將接種好的96孔板放置于細胞培養箱中，使基質膠凝固后加入培養基。
[0026] 更進一步地，所述步驟（1)中，在培養3D類器官后，還包括進一步對3D類器官模 型驗證的步驟；包括（i) 3D類器官形態的觀察；（ii)mRNA水平上證明3D類器官中P-gp的 表達的量；（iii)免疫組織化學法確證P-gp在3D類器官中表達的位置。
[0027] 其中，所述步驟（i)中，將培養好的3D類器官放置在顯微鏡下進行觀察。
[0028] 其中，所述步驟（ii)中，包括mRNA的提取；以mRNA為模板，在逆轉錄酶的作用下 合成cDNA;mdrla引物的設計與驗證；mdrla基因的PCR擴增；
[0029] 其中，所述步驟（iii)中，包括將3D類器官的取材與固定；脫水與浸蠟；包埋與切 片；免疫組化，①脫蠟②抗原修復③去除過氧化氫酶④抗