基于微透鏡成像的抗原抗體反應測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及抗原抗體反應測量技術領域，特別涉及一種基于微透鏡成像的抗原抗 體反應測定方法。
【背景技術】
[0002] 抗原抗體反應檢測分析是目前生物學、基礎醫學研究與臨床研究，以及食品安全、 環境監測等最為重要的檢測分析手段之一。目前抗原抗體反應檢測分析最主要的技術有酶 聯免疫吸附試驗測定技術（ELISA)、表面等離子體共振（SPR)技術以及放射免疫（RIA)法、 熒光免疫測定儀與化學發光免疫測定等。ELISA測定技術將酶催化反應的放大作用和抗原 抗體親和反應的高度專一性、特異性相結合，以酶標記的抗原或抗體作為主要試劑進行免 疫測試，所以具有很高的靈敏度。但是，其檢測操作復雜，步驟繁多，需要先在固相載體（可 采用多孔板、微珠或微管）上包被抗原或抗體，而且包被的條件還需要根據包被的抗原或 抗體先通過實驗進行探索；再加入被檢樣品后還要進行洗滌，然后加特異性的酶標抗體，使 之與結合在固相上的抗原反應結合，然后又再洗滌，再加底物顯色。才能送交酶標儀亦即分 光光度分析儀，通過分析其顯色的波長及強度來進行檢測。整個過程費工費時，需使用大量 較為昂貴的酶標記抗體及標準校樣，且在進行定量檢測時靈敏度與重復性往往不能令人滿 意，實驗條件難以掌握。SPR是20世紀90年代發展起來的一種生物分子檢測技術，它利用 光線在棱鏡與金屬膜表面上發生全反射現象時，會在金屬膜中產生消失波，消失波與表面 等離子波發生共振時，檢測到的反射光強會大幅度地減弱。因此，反射光強的響應曲線有一 最小值尖峰，此時對應的入射光波長為共振波長，對應的入射角為共振SPR角。SPR角隨金 屬表面折射率變化而變化。通過在金膜基片上用共價交聯法固定抗體，當含有匹配的抗原 樣品流經芯片表面時，親和反應將分析物（抗原）捕獲在膜表面，引起該表面折射率的變 化，反射光的共振角也隨之改變。而表面折射率的變化又與其結合的抗原分子質量成正比， 故隨時間的變化，共振強度也會變化。通過注入含有待檢測物質和不含有待檢測物質的緩 沖液，可監測被分析物結合與解離的過程。這就是SPR對抗原抗體反應檢測的基本原理。 SPR儀是一個相當昂貴的儀器系統（約數十萬美元），其缺點是難以解決微型化與多通檢測 問題，容易發生管道堵塞且液流中常會有氣泡產生影響檢測；測量時也需要較多樣品溶液； 機械轉動掃描及二維機械掃描成像，增加了測量的時間和儀器的成本，且會產生磨損偏差； 而且因其原理所限，通常可測折射率范圍很窄（1.33-1. 36)，線性響應的范圍也小，容易產 生折射率偽值。至于放射免疫（RIA)法，因為需要放射性標記可能會對試驗者造成放射性 危害，一般現在已較少應用了。而熒光免疫測定儀與化學發光免疫測定亦都存在儀器價格 昂貴，需要輔助層析條，容易產生假陽性假陰性等問題。
[0003] 目前對抗原抗體反應的檢測不但需求大，而且臨床醫學檢測的要求也越來越高。 首先要求檢測快速、多通同時進行，通常希望能在10分鐘內完成多個樣品的檢測，以便迅 速確定是否存在靶分子，從而為臨床診斷以及有關防疫等工作提供依據。第二是希望檢測 不但是定性的，而且是定量的，有很好的特異性，能較為精確定量地確定樣品內的含有多少 靶分子。而目前用于免疫檢測的主要技術（如ELISA測定技術、SPR技術、熒光免疫測定儀、 化學發光免疫測定儀以及放射免疫（RIA)技術等）都不能同時滿足或大致滿足上述這些需 求。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種基于微透鏡成像的抗原抗體反 應測定方法，該方法操作簡便、快速，不但可實現對抗原抗體反應的定性定量檢測，而且檢 測時不需要任何事先在固相載體上包被抗原或抗體，具有無需任何事先包被抗原或抗體、 事后洗滌，也不需加酶標物、底物顯色等過程，不需輔助試劑盒或層析條等配件材料。
[0005] 本發明的技術方案為：一種基于微透鏡成像的抗原抗體反應測定方法，先將微透 鏡浸沒在帶有抗原的樣品溶液中，在平行光照射下，所成的像是一外周邊緣為暗環的亮圓； 再滴入抗體溶液，抗原抗體發生的反應使得溶液折射率發生變化，從而使得微透鏡像的暗 環粗細發生變化，通過測定暗環的粗細變化并按照用幾何光學原理推導出的方程式計算折 射率在抗原抗體反應前后發生的變化，將變化量的大小與抗原濃度的關系標定曲線，定性 確定是否發生抗原抗體反應并定量確定參與反應的抗原濃度；其中，微透鏡是為一端為球 面，另一端為平面的微透鏡，或者是微球型微透鏡，這些微透鏡通常由玻璃、二氧化硅、聚苯 乙烯等光學透明材料制成。
[0006]對于微球型微透鏡推導出的方程式為：
[0008]而對于一端為球面，另一端為平面的微透鏡，方程式為：
[0009]
[0010] 兩式中，叫為抗原抗體溶液的折射率，η2為微透鏡的折射率，Rb為暗環內亮圓的半 徑，R為微透鏡的半徑。
[0011] 上述過程中，具體包括以下步驟：
[0012] (1)將一微透鏡浸沒在抗原（或含有抗原的樣品）溶液內，然后在平行光照射下成 像，其像的特征為一外周邊緣為一暗環的亮圓，且暗環的粗細與微透鏡折射率與其所浸沒 溶液折射率的差值成正比；
[0013] ⑵測定微透鏡像的半徑R及其中心亮圓的半徑Rbl;
[0014] (3)加入抗體溶液，再次測定微透鏡像的半徑R及其中心亮圓的半徑Rb2;
[0015] (4)利用方程式計算抗原抗體反應前后的溶液折射率變化Δη=n2；g-n2#i;其中， n2；g為加入抗體起抗原抗體反應后的溶液折射率，η2#?為加入抗體起抗原抗體反應前的溶液 折射率。
[0016] (5)配制不同濃度的抗原溶液，分別以上述步驟測定對應每一濃度情況下的Δη， 然后得到An與抗原濃度的關系曲線；
[0017] (6)利用Δη與抗原濃度的關系曲線，可通過測出對某一樣品溶液在加入抗體溶 液前后的An的大小，定性確定是否發生抗原抗體反應并定量確定參與反應的抗原濃度。
[0018] 所述平行光照射的方式是：通過由透鏡組組成的平行光照明系統或相襯顯微鏡進 行照射。
[0019] 所述帶有抗原的樣品溶液為帶有抗原的各種形式的樣品溶液，包括各種臨床血 液、血清或體液；或者食品溶液、防疫與環保現場獲得的溶液；或者人工配制的帶有抗原的 各種形式的樣品溶液等。
[0020] 所述抗體溶液為帶有過量抗體配制的溶液，可以是由血清、水溶液與過量抗體配 制的溶液，或者由BSA、PBS等生物溶液、水溶液與過量抗體配制的溶液。
[0021] 過量抗體為含量比通常臨床樣品中所帶抗原的含量要大的可與之發生特異性抗 原抗體反應的抗體。抗原抗體反應是將抗體溶液直接滴入抗原溶液中產生的反應，而不需 任何事先修飾，也不需要任何事后洗滌與染色作用。
[0022] 所述抗原溶液的用量以浸沒微透鏡為準；所述抗體溶液的用量，一般與帶有抗原 的樣品溶液等容積。
[0023] 所述抗原抗體發生反應前后溶液折射率的變化為Δη，Δη為僅有抗原溶液或樣 品溶液時微透鏡測得的溶液折射率與抗體溶液滴入后5-100秒間微透鏡測得的5-100次溶 液折射率的平均值之間的差值。
[0024] 所述折射率在抗原抗體反應前后發生的變化大小與抗原濃度的關系標定曲線，為 通過配制不同濃度的抗原溶液，分別測定對應每一濃度情況下的An之后，所得到的Δη與 抗原濃度的關系曲線。
[0025] 所述抗原抗體反應測定時，利用動態監測抗原抗體反應過程的折射率隨時間的變 化，測定抗原抗體反應動態學參數，參數包括抗原抗體復合物的生成常數ka和解離常數kd。
[0026] 本發明的作用原理是：當將玻璃、二氧化硅、聚苯乙烯等光學透明材料制成的微透 鏡浸沒到抗原溶液或含有抗原的樣品溶液內時，由于溶液的折射率比微透鏡的折射率小， 故在平行光照射下，由于微透鏡的球面對光的折射作用，使得其背光表面邊緣部分沒有折 射光到達，因而會形成一邊緣暗環。由于微透鏡的折光能力隨其折射率同所在溶液折射率 的差值而變化，故使得邊緣暗環的寬窄程度也隨所在溶液折射率的變化而變化。而抗原抗 體反應時，通常會發生分子團簇現象，改變了溶液中分子的結構，使溶液從親水溶液轉變為 疏水溶液，導致溶液折射率發生明顯變化（一般是升高）。大部分抗原抗體反應前后溶液折 射率的變化的RIU為10 2到10 6間，因此，便使得微透鏡像邊緣暗環的寬窄程度發生明顯變 化。而非抗原抗體反應時溶液折射率的變化則相比要小很多甚至是反方向的變化。故通過 測定微透鏡像邊緣暗環的寬窄程度在抗原抗體反應前后發生的變化，便可了解溶液折射率 的變化△n，從而確定溶液是否發生抗原抗體變化。
[0027] 由于微透鏡成像可快速實時進行，故利用動態監測抗原抗體反應過程的折射率隨 時間的變化，通過反應平衡方程：
[0028] dn/dt=kaCn_- (kaC+kd)η(3)
[0029] 還可測定抗原抗體復合物的生成常數ka與解離常數kd等抗原抗體反應動態學參 數。其中dn/dt為溶液折射率隨時間的變化梯度，C為抗原濃度，η為抗原抗體溶液的折射 率。
[0030] 本發明相對于現有技術，具有以下有益效果：
[0031] 1、本發明的測定方法簡便，操作容易。僅需拍攝下抗原抗體反應即往抗原溶液滴 入抗體溶液前及后微透鏡的圖像并測出微透鏡像中心亮圓對應的兩個半徑Rbl及Rb2分別和 微透鏡半徑R的比值，便可利用方程得到有關折射率變化An，從而根據Δη的大小確定是 否為抗原抗體反應，并定量確定樣品中抗原的濃度。
[00