檢測甲基對硫磷的時間分辨熒光免疫試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物檢測領域，具體的說，涉及一種檢測甲基對硫磷(MP)的時間分辨熒光免疫分析試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002]甲基對硫磷(Parath1n methyl)也叫0，0_ 二甲基_0_對硝基苯硫代磷酸酯，是一種產量大、應用廣的高毒有機磷酸酯類殺蟲劑，由于其毒性較高，近年來已在蔬菜水果上禁止使用。但在蔬菜生產中仍存在農藥亂用、濫用的現象，在農產品的進出口貿易、食品安全的監督檢測中，甲基對硫磷(MP)仍然是常規檢測的重點。
[0003]甲基對硫磷(MP)殘留分析一般使用氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)及氣相色譜質譜聯用技術(GC/MS)，這些方法靈敏、準確，可以同時測定多種藥物，但需要昂貴的儀器，樣品前處理復雜、繁瑣費時、檢測成本較高，而且需專業人員操作，很難滿足對樣品進行現場、批量、快速檢測的需要。因此，開發一種簡單快速、適用于農藥殘留現場監控的分析方法具有重要的現實意義。
[0004]而時間分辨熒光免疫分析法(TR-FIA)由于其特異性強、靈敏度高、操作簡單、廉價，且特別適于大批量樣品的檢測等優點而越來越被人們所重視和采用。目前還沒有針對甲基對硫磷(MP)檢測的時間熒光免疫分析法的專利和文獻報道。
【發明內容】
[0005]為解決以上技術問題，本發明的目的在于提供一種蔬菜水果中甲基對硫磷(MP)殘留的檢測時間分辨熒光免疫分析試劑盒。
[0006]本發明的目的之二在于提供一種快速簡便地檢測蔬菜水果中甲基對硫磷(MP)的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，用于定量或定性地檢測蔬菜水果中甲基對硫磷(MP)殘留量。
[0007]本發明目的之一是這樣實現的:檢測甲基對硫磷(MP)的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，其關鍵在于由多孔包被板、緩沖液、甲基對硫磷(MP)標準品溶液、抗MP的抗體凍干品、銪標記的兔抗鼠抗體、洗滌液和增強液體所組成。
[0008]本發明目的之二是這樣實現的:檢測甲基對硫磷(MP)的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，包括免疫原、包被原和單克隆抗體的制備以及樣品前處理及檢測，其關鍵在于:
(1)免疫原的制備:將半抗原甲基對硫磷(MP)與牛血清白蛋白(BSA)偶聯，得到免疫原(MP-BSA)；
(2)包被原的制備:將半抗原甲基對硫磷(MP)與卵血清白蛋白(0VA)偶聯，得到包被原(MP-0VA)；
(3)單克隆抗體的制備:
a.用步驟(1)的免疫原(MP-BSA)免疫小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗MP的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；
b.以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用ProteinG柱進行純化，獲得抗MP的單克隆抗體IgG ；
c.用步驟(2)的包被原包被96孔包被板；
(4)樣品的前處理及檢測:
取包被有包被原(MP-0VA)的多孔包被板，加入50 μ?的ΜΡ到各自的微孔中，加50 μ?以緩沖液稀釋的抗ΜΡ抗體，25°C?37°C振蕩0.5~1小時，洗滌液洗3次，加以緩沖液稀釋的100 μ? Eu3+ -兔抗鼠抗體，25°C?37°C振蕩0.5~1小時，洗滌液洗6次，加200 μ?增強液振蕩5分鐘后測量熒光強度cps，根據標準曲線計算樣品中的MP含量。
[0009]上述的固相載體是多孔包被板，采用96孔的多孔包被板作為固相載體。
[0010]本發明主要采用時間分辨熒光免疫分析方法來檢測MP。采用時間分辨熒光免疫分析法的技術主要有兩個方面??第一，特異性單克隆抗體制備，用偶聯的免疫原免疫小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗MP的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用Protein G柱進行純化,獲得抗MP的單克隆抗體IgG。第二，Eu3+標記抗體的制備。
[0011]本發明測定方法:測定的基礎是標記免疫反應。包被有MP-0VA的多孔包被板，加入測試樣品到各自的微孔中，再加入抗MP抗體，振蕩反應，游離的MP與微孔板上的MP-0VA競爭抗MP抗體，洗滌液洗滌，沒有連接的MP抗體在洗滌步驟中被除去。加入Eu3+-兔抗鼠抗體，進行標記免疫反應，再用洗滌液洗滌，反應后沒有連接的Eu3+-兔抗鼠抗體在洗滌步驟中被除去。加增強液振蕩后，在紫外燈的激發下發射很強的熒光，用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，熒光強度與樣品中的濃度成反比，對照標準曲線即可確定樣品中MP的量。
[0012]本發明檢測方法不需要昂貴的儀器，樣品前處理簡單、能現場操作檢測，應用廣泛，該方法靈敏、準確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的快速檢測。
【附圖說明】
[0013]圖1為本發明的甲基對硫磷(MP)標準品與抗體的TR-FIA標準抑制曲線圖。
【具體實施方式】
實施例
[0014]1、免疫原與包被原制備
本發明免疫原(MP-BSA)的合成:準確稱取甲基對硫磷324mg溶解在2mL N, N- 二甲基甲酰胺中，攪拌下逐滴加入氨基丁酸溶液，攪拌反應3小時，調節反應液pH 10左右。離心除掉沉淀物。將上述反應逐滴加入BSA溶液中(320mg BSA溶解于5mL生理鹽水)，再加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 23mg, N, N- 二環己基碳二亞胺(DCC) 45.4mg，4°C反應過夜，離心除去沉淀，取上清液用磷酸緩沖液(PBS)透析3天，每6小時更換透析液，將所得產物低壓凍干，于-20°C保存備用；
包被原(MP-0VA)的合成:在上述反應中，將BSA換成0VA后，得到反應偶聯物MP-0VA，該偶聯物作為TR-FIA檢測時作為包被原使用。
[0015]2、單克隆抗體制備
2.1動物免疫
用步驟1制備的免疫原分別免疫6周齡雌性Balb/c小鼠，每只小鼠的免疫劑量為100μδ/0.2mL。首次免疫，用無菌0.0lmol/L pH7.4 PBS溶解免疫原(MP-BSA)，再與等量弗氏完全佐劑混合，完全乳化，勁背部皮下分2?3點注射；加強免疫，用0.01mol/L pH7.4 PBS溶解免疫原與等量弗氏完全佐劑混合，充分乳化，小鼠腹腔注射。每次間隔14?21天，第3次免疫后7?10天開始對免疫小鼠尾靜脈采血，收集血清，用ELISA檢測小鼠血清效價。末次免疫后間隔4周以上，在細胞融合前3?4天，腹腔注射ΜΡ-BSA抗原lOOPg/0.2mL/只，注射后每天注意觀察，保證融合前小鼠狀態良好。
[0016]2.2單克隆抗體制備
分離免疫小鼠的脾細胞，并進行勻漿制備免疫脾細胞。取1只免疫的Balb/c小鼠，從眼眶放血分離血清作為陰性血清，處死。小鼠用75%酒精浸泡5min，進行整體消毒。將小鼠四肢固定，然后用鑷子夾住小鼠下腹部皮膚，剪開一小口，再用鑷子撕開皮膚，露出腹膜，換一套鑷子和剪刀，在腹部中央腹膜上用剪刀剪開一小口。換一套鑷子和剪刀，用剪刀剪開腹膜，露出脾臟，再換一套器械用鑷子夾住脾臟，用剪刀將脾臟外膜剪破，然后放入事先滅菌的勻漿器中。加適量基礎培養基(RPM1-1640)于勻漿器中，進行研磨，擠壓出脾細胞，取出勻漿器的勻漿棒，再補加適量基礎培養基(RPM1-1640)，靜置2min，將上層細胞液吸取后，放入腹腔巨噬細胞離心管中，重復上述操作1次。1200r/min離心lOmin，除去上清。將10s個免疫脾細胞與1?2X107個SP2/0骨髓瘤細胞按照1:10或1:5的比例加入離心管中，進行混勻，然后于1500r/min水平離心lOmin，棄去上清。將離心管倒扣在滅菌的吸水紙上，把管中液體吸干。用手指或桌面輕輕敲擊管底，讓沉淀的細胞松動，再把離心管置于37°C水浴鍋中。在lmin內緩慢將50% PEG 0.8mL滴入離心管中，邊加邊輕輕用吸管尖攪拌沉淀細胞。再繼續攪拌30s后，靜置lmin，然后慢慢加入事先進行37°C預溫的40mL基礎培養基(RPM1-1640)。加基礎培養基方法為:第lmin內逐滴滴入lmL，第2min內逐滴滴入2mL，第3min內逐滴滴入3mL,第4min內逐滴滴入4mL,在每次加培養基時需緩慢加入,并輕輕地攪拌培養基，最后將剩余的RPM1-1640培養基慢慢加入。1000r/min離心5min，除去上清。然后用HAT培養基懸浮混合的細胞，再加入飼養脾細胞。根據需要補加適量的HAT培養基，混合均勻，再將含有飼養細胞的細胞融合液滴加到96孔細胞培養板上，滴加量約為150?/孔。將培養板置于37 °C、5% C02飽和濕度培養箱中，進行培養。用建立的間接ELISA篩選陽性細胞克隆。選擇強陽性集落生長的孔，用有限稀釋法進行克隆。并對其他陽性孔，進行24孔擴大培養，用間接ELISA和間接競爭ELISA對擴大培養孔的上清液進行檢測，對間接ELISA和間接競爭ELISA均為陽性孔的細胞進行液氮冷凍保存。通過融合檢測，并進行3次亞克隆后獲得雜交瘤細胞株。雜交瘤細胞株經過多次傳代、凍存、復蘇，雜交瘤細胞分泌抗體穩定。進行雜交瘤細胞染色體的計數，將每株雜交瘤細胞隨機選擇20個細胞，進行細胞染色體條數的計數，再計算細胞染色體條數的平均值。小鼠脾細胞染色體數為40條，SP2/0細胞的染色體數目平均數為62~68條，而本試驗獲得的20株雜交瘤細胞染色體數目都在92~103條之間，平均為96.8條。本雜交瘤細胞染色體數目高于兩親本細胞的染色體數目，說明是兩種細胞的雜交產物。取細胞株細胞分泌的培養上清液，進行1:10稀釋后，用夾心ELISA方法測定抗體亞型，該細胞株分泌的抗體亞型為IgGl。采用辛酸-硫酸銨法對小鼠腹水進行純化。該單克隆抗體可用于制備時間分辨熒光檢測試劑盒。
[0017]2.3單克隆抗體的純化
采用辛酸-硫酸銨法對小鼠腹水進行純化:取小鼠腹水10mL，加入等體積的巴比妥緩沖液，適量的二氧化硅混合，室溫振蕩30min。室溫靜置15min后，取上清于潔凈離心管中，4°C, 1800r/min離心20min ;取上清液18mL,加入36mL 0.06mol/L醋酸鈉緩沖液，用HC1調pH值至4.5，充分攪拌下在30min內緩慢加入辛酸297 μ? ;繼續攪拌lOmin，然后轉入4°C冰箱靜置2h，4°C，15000r/min離心30min，上清液經0.45Pm濾膜過濾后體積為50mL ;加入5mL 0.lmol/L的磷酸緩沖液，用NaOH調pH值至7.6，攪拌下緩緩加入硫酸銨至終濃度為0.277g/mL ;4°C冰箱靜置 2h 后，4°C, 12000r/min 離心 30min,棄上清；沉淀用 5mL 0.lmol/L的磷酸緩沖液重懸，裝入透析袋，用5000mL 0.01mol/L pH7.2 PBS緩沖液充