一種基于Pt/PdCu-三維石墨烯標記的電化學免疫傳感器的制備及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基于Pt/PdCu納米立方體-三維石墨稀標記的電化學免疫傳感器的制備及應用。具體是采用三維石墨稀負載Pt/PdCu三元合金中空納米立方體材料，制備檢測多種腫瘤標志物的夾心型電化學免疫傳感器，屬于新型功能材料與生物傳感檢測技術領域。
【背景技術】
[0002]腫瘤標志物是指存在于人體組織中可檢測到的反映腫瘤存在的化學類物質。它們在正常成人組織中含量極低或者不存在，但是在患者體內其含量遠遠超過在正常成人的含量，他們的存在或量變表明了腫瘤性質，人們以此來了解腫瘤的組織發生、細胞分化、細胞功能，以幫助腫瘤的診斷、分類、預后判斷以及治療指導。腫瘤標志物的快速、靈敏電化學免疫檢測為腫瘤早期發現和診斷提供了可能，因此，在臨床研究上，發展一種快速、簡便、靈敏的檢測腫瘤標志物方法是十分重要的。
[0003]目前腫瘤標志物的臨床檢測方法已經有很多，如放射免疫分析、酶聯免疫分析、化學發光免疫分析等。電化學免疫傳感器是將免疫學方法與電化學方法相結合的一種生物傳感器，利用抗原與抗體之間的特性性結合，使得它具有高靈敏性、高選擇性、分析快速和操作簡便等優點。
[0004]本方法采用溶劑熱合成的方法，制備了三維石墨烯負載Pt/PdCu納米立方體材料，通過金屬與氨鍵的結合，實現了檢測抗體的固定，將三維石墨稀負載Pt/PdCu納米立方體材料引入傳感器的制備中，構建了一種超靈敏的夾心型免疫傳感器。在不使用酶的情況下，三維石墨稀負載Pt/PdCu中空納米立方體對雙氧水有良好的催化能力，并在檢測過程中產生了良好的電化學信號，有效降低了傳感器的檢出限，可用于多種腫瘤標志物的分析。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是基于三維石墨稀負載Pt/PdCu納米立方體材料，實現了對抗體的多重標記，構建了一種無酶、快速且超靈敏的夾心型電化學免疫傳感器。
[0006]本發明的技術方案如下:
1.一種基于Pt/PdCu納米立方體-三維石墨稀標記的電化學免疫傳感器的制備，其特征在于，包括以下步驟:
(1)將直徑為4mm的玻碳電極用A1203拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)取6μ?、0.5~1.5 mg *mL 1環糊精功能化的石墨稀溶液滴加到電極表面，室溫下瞭干，用超純水沖洗電極表面，晾干；
(3)滴加6μ?、5~10 μδ.πι? 1的抗體，晾干后用超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中晾干；
(4)滴加3PL質量分數為1%的牛血清白蛋白溶液，晾干后用超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中晾干； (5)滴加6μ?、0.0001-30 ng/mL的一系列不同濃度的抗原溶液，晾干后用超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中晾干；
(6)取6PL的Pt/PdCu-三維石墨烯二抗標記物溶液，滴涂于電極表面，置于4 °C冰箱中晾干，制得Pt/PdCu-三維石墨烯構建的免疫傳感器。
[0007]2.一種基于Pt/PdCu納米立方體-三維石墨烯標記的電化學免疫傳感器的制備，所述的Pt/PdCu納米立方體-三維石墨稀溶液，制備步驟如下:
(1)取1.5 mL、5.7-7.7 mg.mL 1 PdCl2S液，3.2 mL、7.0~9.0 mg.mL 1 氧化石墨稀溶液，10~20 mg CuS04.5H20，40~60 mg谷氨酸鹽置于250 mL燒杯中，再加入35~45 mL乙二醇，超聲，磁力攪拌2 h ;用7?9 wt% Κ0Η/乙二醇溶液調節pH到13左右；將混合溶液移入50 mL高壓反應釜中，160 °C條件下加熱6~8 h，冷卻至室溫；
(2)將所得物質移入含有15-25 mg 谷氨酸鹽，0.9 mL、2.5-3.5 mg.mL 1 H2PtCl6.6Η20的乙二醇溶液的燒杯中，用7~9 wt% Κ0Η/乙二醇溶液調節pH到13左右，然后移至反應釜，在 160 °C 下反應 2.5-3.5 h ；
(3)用超純水洗滌幾次，將洗滌后的物質放入冰箱中冷凍結冰，最后用冷凍干燥機干燥得到Pt/PdCu納米立方體-三維石墨稀。
[0008]3.一種基于Pt/PdCu納米立方體-三維石墨烯標記的電化學免疫傳感器的制備，用于各種腫瘤標志物的檢測，檢測步驟如下:
(1)使用電化學工作站連接飽和甘汞電極，鉑絲電極，制備的免疫傳感器電極，底液為10 mL、pH值為7.0的PBS緩沖溶液；
(2)用時間-電流法對分析物進行檢測，輸入電壓為-0.4V，取樣間隔0.1 s，運行時間 200 s ；
(3)當背景電流趨于穩定后，每隔50s向10 mL的PBS中注入10 μ L 5 mol/L的雙氧水溶液，然后記錄電流變化；
(4)根據所得電流強度與腫瘤標志物濃度之間的線性關系，繪制工作曲線。
[0009]4.本發明所述的腫瘤標志物選自以下之一:鱗狀癌細胞抗原(SCCA)、癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、乳腺癌易感基因(CA15-3)、卵巢癌糖類抗原(CA125)、前列腺特異性抗原(PSA)。
[0010]本發明的有益成果
(1)利用溶劑熱方法合成的三維石墨稀負載Pt/PdCu三元合金中空納米立方體復合材料，比表面積大，可以有效地捕獲更多的檢測抗體，而且還保留了良好的催化性能；
(2)利用環糊精功能化的石墨稀納米復合材料具有尚的導電性、良好的生物相容性，大的比表面積，良好的分散性和高的分子識別能力；
(3)利用環糊精與捕獲抗體主客體分子識別作用，實現了抗體的固定，有效地防止檢測過程中標記物的脫落；
(4)本發明制備的電化學免疫傳感器用于多種腫瘤標志物的檢測，響應時間短，檢測限低，線性范圍寬，可以實現簡單、快速、高靈敏和特異性檢測。
【具體實施方式】
[0011]實施例1 一種基于Pt/PdCu納米立方體-三維石墨烯標記的電化學免疫傳感器的制備
將直徑為4 mm的玻碳電極用A1203拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
取6 μ?、0.5 mg.mL 1環糊精功能化的石墨烯溶液滴加到電極表面，室溫下晾干，用超純水沖洗電極表面，晾干；
滴加6 μ?、5 Pg-mL1的抗體，晾干后超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中干燥；
滴加3 μ?質量分數為1%的牛血清白蛋白溶液，晾干后用超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中晾干；
滴加6 μ?、0.0001-30 ng/mL的一系列不同濃度的抗原溶液，晾干后超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中干燥；
取6 PL的Pt/PdCu-三維石墨烯二抗標記物溶液，滴涂于電極表面，置于4 °(:冰箱中晾干，制得Pt/PdCu-三維石墨烯構建的免疫傳感器。
[0012]實施例2 —種基于Pt/PdCu納米立方體-三維石墨烯標記的電化學免疫傳感器的制備
將直徑為4 mm的玻碳電極用A1203拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
取6 μ?、1.0 mg.mL 1環糊精功能化的石墨烯溶液滴加到電極表面，室溫下晾干，用超純水沖洗電極表面，晾干；
滴加6 μ?,?.5 Pg.mL 1的抗體，晾干后超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中干燥；
滴加3 μ?質量分數為1%的牛血清白蛋白溶液，晾干后用超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中晾干；
滴加6 μ?、0.0001-30 ng/mL的一系列不同濃度的抗原溶液，晾干后超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中干燥；
取6 PL的Pt/PdCu-三維石墨烯二抗標記物溶液，滴涂于電極表面，置于4 °(:冰箱中晾干，制得Pt/PdCu-三維石墨烯構建的免疫傳感器。
[0013]實施例3 —種基于Pt/PdCu納米立方體-三維石墨烯標記的電化學免疫傳感器的制備
將直徑為4 mm的玻碳電極用A1203拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
取6 μ?、1.5 mg.mL 1環糊精功能化的石墨烯溶液滴加到電極表面，室溫下晾干，用超純水沖洗電極表面，晾干；
滴加6 μ?、10 Pg.mL1的抗體，晾干后超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中干燥；
滴加3 μ?質量分數為1%的牛血清白蛋白溶液，晾干后用超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中晾干；
滴加6