一種檢測糖化血紅蛋白的試劑盒及其制備方法和使用方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及糖化血紅蛋白檢測技術領域，尤其涉及一種檢測糖化血紅蛋白的試劑 盒及其制備方法和使用方法。
【背景技術】
[0002] 糖化血紅蛋白（HbAlC)是血液中紅細胞內血紅蛋白與血糖結合的產物。血糖通過 彌散方式進入細胞內，無需胰島素參與。血糖與血紅蛋白的結合過程緩慢且不可逆，在紅細 胞死亡前一直存在，故體內衰老紅細胞比新生紅細胞的糖化血紅蛋白含量高出1.5倍。血 紅蛋白的平均壽命長達120天，且HbAlC的生成速度與過去2-3個月內血糖濃度水平成正 比，毫無疑問，HbAlC水平能夠更準確地反映過去2-3個月中人體內的血糖情況。糖化血紅 蛋白越高表示血糖與血紅蛋白結合越多，糖尿病病情也越嚴重。檢測HbAlC水平可避免每 日的血糖值波動的影響，與抽血時間，是否空腹，是否使用胰島素等因素無關。當糖尿病控 制較好時HbAlC濃度在一定值范圍內，糖尿病控制不住時HbAlC濃度則可高至正常值的2 倍以上，因此檢測HbAlC水平成為糖尿病治療過程中療效監測的重要手段。HbAlC檢測用于 常規實驗室始于20世紀70年代末，且穩定發展至今，糖化血紅蛋白濃度已成為了解糖尿病 控制良好與否的重要指標。國外已將糖化血紅蛋白濃度監測作為糖尿病療效判定和調整治 療方案的"金標準"。
[0003] 目前，臨床常用的測定HbAlC的方法主要有酶聯免疫法、膠乳免疫凝集法和離子 樹脂微柱層析法等。酶聯免疫法是使用酶聯免疫測定技術測定HbAlC，使用酶標儀、洗板機 等，該方法操作繁瑣，耗時長，受影響因素較多。膠乳免疫凝集法是利用抗原抗體反應形成 復合物的自然凝集效果，以膠乳放大凝集信號，測定反應液濁度，一般使用全自動生化分析 儀，目前應用比較廣泛，但其受到方法及使用儀器限制，標本需集中測定。離子樹脂微柱層 析法是利用離子樹脂的特異性吸附作用，將樣本流過離子樹脂層析柱，從而將HbAlC從樣 本中分離出來，再與總血紅蛋白比較測定其含量，特異性高、精密度高、重復性好，在臨床上 有廣泛應用，但是操作繁瑣，耗時很長，受環境溫度、揮發性酸堿物質影響大，如果不是熟練 人員則人為誤差也很大；另外，有改進自然層析為負壓引流或者正壓擠出的方法，這種改進 方法僅是縮短了一定的操作時間，但同時帶來了液體因流速過快跟樹脂接觸時間短而吸附 不完全的弊端。
【發明內容】
[0004] 本發明針對現有的糖化血紅蛋白檢測方法操作繁瑣，耗時很長，人為誤差大等問 題，提供一種靈敏度高，特異性強，檢測方便快捷的用于檢測糖化血紅蛋白的試劑盒，以及 該試劑盒的制備方法和使用方法。
[0005] 為實現上述目的，本發明采用以下技術方案。
[0006] -種檢測糖化血紅蛋白的試劑盒，包括反應液、洗滌液和反應板，所述反應板上設 有濾月吳；
[0007] 每IOmL所述反應液由以下各組分組成：12. 0-16. 5mg氯化鋅，116. 5-127. 5mg氯化 鈉，30. 0-31. Omg 六水氯化鎂，238. 0-339. Omg HEPES，18. 5-29. 5mg 甘氨酸，39-41mg 氫氧化 鈉，0.111^濃度為15%的1^切11乂-100,0.051^濃度為15%的疊氮化鈉，余量為水；所述反 應液的pH為7. 9-8. 3 ;
[0008] 每5mL所述洗滌液由以下各組分組成：0. 09-0. 15mL的甲酰胺，0. 54mL濃度為 3. 15g/L 的 XC-DAP0L-CPBA 溶液，余量為水。
[0009] 優選的，每IOmL所述反應液由以下各組分組成：14. 4mg氯化鋅，118. 9mg氯化鈉， 30. 5mg六水氯化鎂，298. 3mg HEPES，28. 8mg甘氨酸，40mg氫氧化鈉，0· ImL濃度為15 %的 1^切11乂-100,0.051^濃度為15%的疊氮化鈉，余量為水；所述反應液的？!1為8.1。
[0010] 優選的，每5mL所述洗滌液由以下各組分組成：0. 12mL的甲酰胺，0. 54mL濃度為 3. 15g/L 的 XC-DAP0L-CPBA 溶液，余量為水。
[0011] 以上所述反應液和洗滌液在2-8°C下保存。
[0012] 以上所述檢測糖化血紅蛋白的試劑盒的制備方法，包括以下步驟：
[0013] Sll制備反應液：將氯化鋅溶于水中，得第一溶液；將氯化鈉、六水氯化鎂、疊氮化 鈉和Triton X-100溶于水中，得第二溶液；將第一溶液與第二溶液混合均勻，得第三溶液；
[0014] 將氫氧化鈉溶于水中，得第四溶液；將HEPES和甘氨酸溶于第四溶液中，得第五溶 液；
[0015] 將第五溶液與第三溶液混合均勻，得混合液，向混合液中加入水至混合液的體積 為10mL，然后將混合液的pH調至7. 9-8. 3,制得反應液；備用。
[0016] 優選的，將氯化鋅溶于2. 5mL的水中，得第一溶液；將氯化鈉、六水氯化鎂、疊氮化 鈉和Triton X-100溶于2. 5mL的水中，得第二溶液；將氫氧化鈉溶于I. 5mL的水中，得第四 溶液。
[0017] S12制備洗滌液：將甲酰胺與XC-DAP0L-CPBA的甲酰胺溶液混合均勻，然后向混合 液中加入水至混合液的體積為5mL，制得洗滌液；備用。
[0018] S13組合：所述的反應液、洗滌液與設有濾膜的反應板組成試劑盒。
[0019] 以上所述檢測糖化血紅蛋白的試劑盒的使用方法，包括以下步驟：
[0020] S21反應：向反應液中加入5yL全血，充分震蕩，然后靜置2-3min使全血與反應 液反應完全，得混懸液；震蕩混懸液使混懸液均勻。
[0021] 優選的，向25 μ L反應液中加入5 μ L全血。
[0022] S22沉淀和洗滌：將混懸液滴加到反應板上，靜置IOs以上使混懸液充分浸入濾膜 內；然后向反應板中滴加洗滌液，靜置IOs以上使洗滌液充分浸入濾膜內。
[0023] 優選的，將25 μ L混懸液滴加到反應板上；向反應板中滴加25 μ L洗滌液。
[0024] S23檢測：在5min內用糖化血紅蛋白檢測儀檢測與硼酸結合物結合的藍色的糖化 血紅蛋白在波長為620nm的光下的反射率Rl與紅色的總體血紅蛋白在波長為470nm的光 下的反射率R2,計算Rl與R2的比值即為檢測樣品中HbAlC的濃度。
[0025] 本發明試劑盒的原理為：反應液中含有可裂解紅細胞并使血紅蛋白沉淀的物質及 可與糖化血紅蛋白的順式-二醇基結合的藍色硼酸結合物，當血液滴入反應液中時，紅細 胞立即被裂解，所有的血紅蛋白沉淀，硼酸結合物則與糖化血紅蛋白的順式-二醇基結合。 將適量的反應混合物置于反應板上，所有已沉淀的血紅蛋白無論其是否被硼酸結合物所結 合，都將殘留在濾膜之上，然后用洗滌液洗去多余的染色綴合物。最后使用血紅蛋白檢測儀 對藍色（糖化血紅蛋白）與紅色（總體血紅蛋白）分別在波長是620nm和470nm的光下的 反射率進行分析，計算二者的比值，比值即為樣品中HbAlC的濃度。
[0026] 與現有技術相比，本發明的有益效果是：本發明根據糖化血紅蛋白結合染料硼酸 結合物后在固定波長下的反射率與總的血紅蛋白的反射率的比值，計算血液中糖化血紅蛋 白的含量，利用其高靈敏度、高特異性的特點，設計新的原料、試劑和工藝流程。本發明提 供的試劑盒具有靈敏度高和特異性好及檢測方法簡單快捷的特點，五分鐘即可完成測量報 告，大大縮短了操作時間，提高了檢測效率，并且性價比高，適用于臨床快速檢測，可廣泛應 用于各級醫療檢驗機構，尤其基層醫療機構包括鄉鎮衛生院均可開展。
【附圖說明】
[0027] 圖1為分別使用實施例中所述試劑盒和美國Bio-Rad公司生產的糖化血紅蛋白檢 測試劑盒檢測相同樣本的檢測結果對比圖。
【具體實施方式】
[0028] 為了更充分理解本發明的技術內容，下面結合具體實驗對本發明的技術方案作進 一步介紹和說明。下述實驗中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規方法；所使用的材 料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業途徑得到的試劑和材料。
[0029] 實施例
[0030] 本實施例提供一種檢測糖化血紅蛋白的試劑盒，以及該試劑盒的制備方法和使用 方法。該試劑盒由反應液、洗滌液和反應板組成，所述反應板上設有濾膜，用于沉淀血紅蛋 白。
[0031] 所述反應液的體積為10mL，反應液由以下各組分組成：14. 4mg氯化鋅，118. 9mg 氯化鈉，30. 5mg六水氯化鎂，298. 3mg HEPES，28. 8mg甘氨酸，40mg氫氧化鈉，0· ImL濃度為 15%的Triton X-100,0. 05mL濃度為15%的疊氮化鈉，余量為水；反應液的pH為8. 1。反 應液在2-8 °C下保存，備用。
[0032] 所述洗滌液的體積為5mL，洗滌液由以下各組分組成：0. 12mL的甲酰胺，0. 54mL濃 度為3. 15g/L的XC-DAP0L-CPBA甲酰胺溶液，余量為水。洗滌液在2-8°C下保存，備用。
[0033] 本實施例的試劑盒的制備方法如下：
[0034] (11)制備反應液
[0035] 將氯化鋅溶于2. 5mL的水中，得第一溶液；將氯化鈉、六水氯化鎂、疊氮化鈉和 Triton X-100溶于2. 5mL的水中，得第二溶液；將第一溶液與第二溶液混合均勻，得第三溶 液。
[0036] 將0. 2mL 5M的氫氧化鈉溶于I. 5mL的水中，得第四溶液；將HEPES和甘氨酸溶于 第四溶液中，得第五溶液。
[0037] 將第五溶液與第三溶液混合均勻，得混合液，向混合液中加入水至混合液的體積 為10mL，然后將混合液的pH調至8. 1，制得反應液。
[0038] 反應液在2-8 °C下保存，備用。
[0039] (12)制備洗滌液
[0040] 將甲酰胺與XC-DAP0L-CPBA的甲酰胺溶液混合均勻，然后向混合液中加入水至混 合液的體積為5mL，制得洗滌液。
[0041] 洗滌液在2-8 °C下保存，備用。
[0042] (13)組合
[0043] 上述的反應液、洗滌液與設有濾膜的反應板組成試劑盒。
[0044] 本實施例的試劑盒的使用方法如下：
[0045] (21)反應
[0046] 向25 μ L反應液中加入5 μ L全血，充分震蕩，然后靜置2_3min使全血與反應液