一種熒光光片顯微成像系統及方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種顯微鏡系統，特別是涉及一種熒光光片顯微成像系統及方法。
【背景技術】
[0002] 1993 年，Voie A. H.等人發明 了光片顯微鏡（Orthogonalplane Fluorescence Optical Sectioning，0PF0S)，它使用片層光橫向照明透明生物組織，從而實現生物組織不 同深度的顯微成像。但由于當時的成像分辨率較低，且不能用來做活細胞測量，未在隨后 的十年中得到應用。直到2004年，Huisken J.和Stelzer E.H.等人應用圓柱形透鏡將入 射激發光通過入射物鏡聚焦到樣本上并形成靜態高斯光片，然后通過高數值孔徑熒光物鏡 觀測，建立了第一代靜態焚光光片顯微鏡（Selective Plane Illumination Microscopy， SP頂)，并在之后的活體熒光成像中得到了應用。但是，第一代靜態熒光光片顯微鏡的主要 缺點是構造的光片厚度在8~10微米且不均勻，不能夠做定量測量，且在成像組織深層時 圖像對比度下降很快。2008年，Keller P.J.和Stelzer E.H.等人發明了第二代掃描型 熒光光片顯微鏡。在該顯微成像系統中，入射激發光通過管透鏡和入射物鏡在樣本中形成 一條聚焦的線，通過掃描反射鏡和f-theta物鏡使得聚焦光線在組織平面一維快速掃描， 從而產生一個虛擬的光片，產生的受激發射熒光經由高數值孔徑熒光物鏡和中繼透鏡被超 高靈敏度C⑶(Electron-Multiplying C⑶，EM(XD)記錄，被稱為數字掃描型熒光光片顯微 鏡（Digital Scanned Light Sheet Microscopy，DSLM)。隨后 2010 年，Keller P.J.等人 發明了將結構光照明（Structure Light Illumination，SIM)引入掃描型焚光光片顯微鏡 中，提高了顯微成像的空間分辨率，并觀察到兩種顏色標記下的細胞核和細胞膜動態變化。 2012年，Tomer R.等人發明了改進型的熒光光片顯微鏡系統，它通過左、右兩側物鏡同時照 明來產生更均勻的激發光片，并在樣本的上、下兩側分別使用觀測物鏡盡可能多地收集受 激發射熒光信號。運用上述掃描光片顯微鏡，近幾年國內外多個研究機構開展了細胞生物 學、發育生物學以及神經科學的活體成像研究。
[0003] 由于熒光光片顯微鏡原理上是2D成像，其成像時間分辨率要顯著優于共聚焦顯 微鏡和雙光子顯微鏡的時間分辨率。但是，熒光光片顯微鏡的空間分辨率會受到對激發光 片的厚度限制以及成像組織的深度限制，使其低于共聚焦顯微鏡和雙光子顯微鏡的空間分 辨率。2014年，Eric B.和Kai W.等人提出了基于成像視場各等暈區內波前畸變傳感和校 正的雙光子熒光顯微鏡，使得清晰成像組織的深度達到了 200多微米。但是，不同于逐點掃 描模式的雙光子顯微鏡，逐層掃描模式的光片顯微鏡并不適用上述的波前畸變傳感和校正 方法。為此，需要研究適用于大視場、高時空分辨率、深層生物組織的熒光光片顯微鏡的新 型波前畸變傳感和校正方法。
[0004] 因此，希望有一種技術方案來克服或至少減輕現有技術的至少一個上述缺陷。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種熒光光片顯微成像系統及方法來克服或至少減輕現 有技術中的至少一個上述缺陷。
[0006] 為實現上述目的，本發明提供一種熒光光片顯微成像系統，所述熒光光片顯微成 像系統包括檢測裝置、校正裝置、成像裝置和控制裝置，其中：所述檢測裝置用于檢測活體 樣本內部的組織平面成像視場的各預設等暈區的波前像差畸變，并輸送給所述控制裝置， 所述控制裝置用于根據接收到的所述波前像差畸變，向所述校正裝置發出校正指令，所述 校正裝置用于根據接收到的所述校正指令，對各所述等暈區同時進行至少一次波前校正， 所述成像裝置用于對波前校正后的所述組織平面成像。
[0007] 進一步地，所述校正裝置至少包括第一校正器和第二校正器，其中：所述第一校正 器用于波前校正所述各等暈區的波前像差畸變相同部分，所述第二校正器用于波前校正所 述各等暈區的波前像差畸變差異部分。
[0008] 進一步地，所述檢測裝置至少包括熒光激發單元、第一波前傳感器和第二波前傳 感器，其中：所述熒光激發單元可操作地向所述組織平面照射激發光或點，所述第一波前傳 感器用于接收所述組織平面經所述激發光照射后產生的受激發射熒光，并檢測出該熒光位 于所述各等暈區時的波前像差畸變，所述第二波前傳感器用于接收并檢測經由所述第一校 正器波前校正后的所述各等暈區的剩余波前像差畸變。
[0009] 進一步地，所述檢測裝置還包括第一位置調整單元和第二位置調整單元，所述第 一位置調整單元和所述第二位置調整單元依次設于所述熒光激發單元和所述成像裝置之 間，并用于調整所述激發光照射在所述組織平面上的光斑位置。
[0010] 進一步地，所述成像裝置包括載物臺、片光照明單元、顯微物鏡、會聚透鏡和圖像 探測器，其中：所述載物臺用于支承所述活體樣本，且界定了所述活體樣本的軸線以使大致 安置在所述軸線上的樣品成像；所述片光照明單元可操作以在與所述活體樣本相交的所述 組織平面內產生激發片層光；所述顯微物鏡和會聚透鏡用于對波前校正后的所述組織平面 放大成像在顯微成像面，所述圖像探測器的探測面與所述顯微成像面重合。
[0011] 進一步地，所述熒光光片顯微成像系統還包括第一遠心成像光路和第二遠心成像 光路，所述第一遠心成像光路具有第一出曈面和第二出曈面，所述第二遠心成像光路具有 第三出曈面和第四出曈面，所述第一出曈面設所述顯微物鏡的后出光端面，所述第三出曈 面與所述第二出曈面垂直相交且交點處設所述第一位置調整單元，所述第四出曈面設所述 第二位置調整單元。
[0012] 進一步地，所述熒光光片顯微成像系統還包括第三遠心成像光路和第四遠心成像 光路，所述第三遠心成像光路具有第五出曈面和第六出曈面，所述第四遠心成像光路具有 第七出曈面和第八出曈面，所述第五出曈面與所述第四出曈面垂直相交且交點處設所述第 二位置調整單元，所述第七出曈面與所述第六出曈面相交且交點處設所述第一校正器，所 述第八出曈面設所述第一波前傳感器。
[0013] 進一步地，所述熒光光片顯微成像系統還包括第五遠心成像光路和第一透/反切 換器，所述第五遠心成像光路具有第九出曈面和第十出曈面，所述第一透/反切換器位于 所述第四遠心成像光路中，并用于使所述熒光經所述第一透/反切換器能夠透射到達所述 第一波前傳感器以及使所述熒光或所述激發片層光經所述第一透/反切換器能夠反射到 達所述第四遠心成像光路的另一所述第八出曈面，所述另一第八出曈面后方預設距離的所 述第九出曈面設所述第二校正器，所述第十出曈面設所述第二波前傳感器。
[0014] 進一步地，所述熒光光片顯微成像系統還包括第二透/反切換器，所述第二透/反 切換器位于所述另一第八出曈面在所述第五遠心成像光路中的像面上，并用于使所述熒光 經所述第二透/反切換器能夠透射到達所述第二波前傳感器以及使所述激發片層光經所 述第二透/反切換器能夠反射到達所述圖像探測器。
[0015] 進一步地，所述圖像探測器沿其光軸前后移動能夠接受并檢測所述第二透/反切 換器所在的出曈面的波前像差畸變，該波前像差畸變也可由所述第一校正器進行波前校 正。
[0016] 進一步地，所述第一遠心成像光路的第一透鏡、第二遠心成像光路、第三遠心成像 光路和第四遠心成像光路的焦距均為f，所述第五遠心成像光路的焦距均為I. 5f，所述另 一第八出曈面與所述第九出曈面的預設距離為0. 5f，所述第二透/反切換器與所述另一第 八出曈面的距離為6f，所述第一遠心成像光路、第二遠心成像光路、第三遠心成像光路、第 四遠心成像光路和第五遠心成像光路還分別具有像面、出曈面以及后出瞳面，各所述像面 成共輒關系，各所述出曈面成共輒關系，各所述后出曈面成共輒關系。
[0017]