釕基金屬配合物光致發光測定酵母rna的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于光化學傳感領域，涉及三種相似的多吡啶釕（II)配合物的合成方法 及其在發致發光測定酵母RNA等相關領域中的應用。
【背景技術】
[0002] 核酸（DNA和RNA)的堿基中儲存著大量的遺傳信息，是生物體的重要組成物質，它 們在蛋白質的生物合成中發揮關鍵作用，與生物的繁殖和生長發育等生命活動息息相關， 也是癌癥和AIDS等疾病診斷和化學治療藥物的靶點。因此研究制備可以特異性結合并測 定核酸的分子探針對推動生命科學和醫學的進步以及整個人類的健康發展都具有十分重 要的意義[Campisi，D. ;Morii，T. ;Barton，J.K.Biochemistryl994,33,4130·]。在過去 的幾十年中，各種各樣的金屬配合物是核酸探針研發領域的熱點，尤其是多吡啶釕（II)配 合物，因其具有豐富的光物理、光化學和氧化還原性質，與核酸之間的相互作用得到了廣泛 而深入的研究。1990年，Barton等人報道了 [Ru(bpy)2(dppz)]2+(bpy= 2,2' -聯吡啶， dppz=二吡啶并[3, 2-a:2'，3' -c]吩嗪）和[Ru(phen)2(dppz)]2+(phen= 1，10-鄰菲略 啉）在水溶液中可作為DNA的分子光開關[Pyle，A.M. ;Morii，T. ;Barton，J.K.J.Am.Chem. Soc. 1990,112,9432. (b)Sitlani,A. ；Long,E.C. ；Pyle,A.M. ；Barton,J.K.J.Am.Chem. Soc. 1992,114. 2303.]。在此基礎上，許多科研工作者致力于研發光開關性能更優的配合 物。首先對上述兩種配合物的配體dppz進行修飾獲得衍生物，但光開關性能沒有獲得預 期的改善。近年來，研究者將注意力轉移到含dpq(dpq=二吡啶并[3,2_d:2'，3' -f]_喹 喔啉）配體的配合物上，該配體結構與dppz相似，但共輒性不如dppz。含dpq衍生配體 的配合物[Ru(phen)2(dcdpq)]2+(dcdpq= 6,7_ 二氰基二吡啶并[3,2_d:2' 3' -f]喹喔 啉）和[Ru(phen) (dcdpq)2]2+表現出DNA光開關行為，與DNA鍵合后焚光增強因子分別為 16 和8,配合物[Ru(phen)2(dpqa)]2+(dpqa= 2-(N_ 戊基酰胺基）二吡啶并[3,2_f:2'， 3'-h]_ 喹喔啉）與DNA鍵合后熒光大幅增強[Ambroise，A. ;Maiya，B.G.Inorg.Chem. 2000， 39,4264.0'Donoghue，K.A. ;Penedo，J.C. ;Kelly，J.M. ;Kruger，P.E.DaltonTrans. 2005， 1123. 0'Donoghue，K.A. ;Kelly，J.M. ;Kruger，P.E.DaltonTrans. 2004,13.Daleney， S. ；Pascaly? M.；Bhattacharya? P. K. ;Han，K.；Barton? J. K. Inorg.Chem.2002? 41? 1966. Collins? J. G.；Sleeman? A. D.；Aldrich-ffright? J. R.；Greguric? I. ;Hambley， T. W.Inorg.Chem. 1998, 37,3133.Greguric，I. ;Aldrich_Wright，J.R. ;Norden，B.J.Am. Chem.Soc. 1997,119, 3621.]。我們課題組曾報道了帶有羧基的dpq作為配體的配合物 [Ru(phen) 2 (Hcdpq)]2+(Hcdpq= 2-羧基二吡啶并[3，2-d:2'，3'-f]-喹喔啉）的DNA光開 關性質，并證明該配合物可將DNA和酵母RNA區別開來，由于它與RNA鍵合前后熒光強度 幾乎沒有明顯變化[Zhang，A.G. ;Zhang，Y.Z. ;Duan，Z.M. ;Wang，K.Z. ;Wei，H.B. ;Bian， Z.Q. ;Huang，C.H.Inorg.Chem.2011，50,6425-6436·]。到目前為止，已有許多基于釕（II) 配合物的DNA分子光開關，然而釕（II)配合物與RNA之間的相互作用的研究主要集中在 鍵合性質、鍵合模式等研究方面，鮮有RNA的分子光開關被報道。我們課題組還曾報道了 三個分別以dpq的衍生物作為配體的配合物[Ru(bpy)2(bipp)]2+、[Ru(bpy)2(bopp)]2+和[Ru(bpy) 2 (btpp) ]2+ (配體bipp，bopp和btpp分別是將苯并咪唑基、苯并惡唑基和苯并噻挫 基連接到dpq上得到的）表現出優良的DNA分子光開關性質[Han，M.J. ;Duan，Z.M. ;Hao， Q. ;Wang，K.Z.J.Phys.Chem.C2007,111，16577-16585.]，為了推進RNA分子光開關的研究， 我們進一步研究了這三種配合物在水體系中與酵母RNA的相互作用，結果表明，這三種配 合物與酵母RNA作用后都出現了明顯的熒光增強現象，可作為一類新的RNA分子光開關，通 過光致發光快速、簡便地實現對酵母RNA的檢測，在酵母RNA的測定方面具有十分重要的應 用價值。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是利用三種結構相似的釕（II)配合物[Ru(bpy)2(bipp)] (C104)2、 [Ru(bpy)2(bopp)] (C104)2和[Ru(bpy) 2(btpp)] (C104)2在酵母RNA存在下發光增強的性質， 通過光致發光對生理pH下的水緩沖體系中的酵母RNA實現定量測定。
[0004] 本發明的技術方案如下：首先，分別合成主配體bipp，bopp和btpp;然后使主配體 分別與[Ru(bpy)2Cl2] ·2Η20反應，得到配合物[Ru(bpy)2(bipp)] (C104)2、[Ru(bpy)2(bopp)] (C104) 2和[Ru(bpy) 2 (btpp) ] (C104) 2，并通過柱色譜方法提純；最后，測定配合物在 Tris-HCl緩沖溶液中隨著酵母RNA的濃度增加而產生的熒光發射光譜變化，在熒光強度隨 RNA濃度線性增長的范圍內作出工作曲線，從而通過配合物的光致發光達到定量檢測酵母 RNA的目的。
[0005]與現有技術相比，本發明的優勢在于：
[0006]本發明所制備的舒配合物[Ru(bpy)2(bipp)] (C104)2、[Ru(bpy)2(bopp)] (C104)2和 [Ru(bpy)2(btpp)](C104)2在水緩沖溶液中發光很弱或不發光，加入酵母RNA后，配合物發 光均大幅增強，三種配合物是優良的酵母RNA的分子光開光，通過光致發光手段可快速、簡 便地實現對酵母RNA的定量檢測。對酵母RNA的檢測可在處于生理pH的水體系中進行， 所能檢測的酵母RNA的濃度很低，[Ru(bpy)2(bipp)] (C104)2、[Ru(bpy)2(bopp)] (C104)2和 [Ru(bpy) 2 (btpp) ] (C104) 2對酵母RNA的檢出限濃度分別為 0· 06μM，0· 3μM和 0· 6μM。因 此，本發明中的三種釕（II)配合物在生理pH下的水體系中對酵母RNA的測定具有重要的 應用價值。
【附圖說明】
[0007] 圖 1 是配合物[Ru(bpy)2(bipp)] (C104)2、[Ru(bpy)2(bopp)] (C104)2和 [Ru(bpy) 2 (btpp) ] (C104) 2的結構示意圖。
[0008] 圖 2 是配合物[Ru(bpy)2(bipp)] (C104)2(4. 6μΜ)的Tris-HCl溶液（5mM，pH= 7. 1)在酵母RNA濃度為0-160μM范圍內發射光譜（λ450nm)，插圖是根據發射光譜數 據繪制的測定酵母RNA(0-17μΜ)的工作曲線。
[0009] 圖 3 是配合物[Ru(bpy) 2 (bopp) ] (C104) 2 (6μΜ)的Tris-HCl溶液（5mM，pH= 7. 1) 在酵母RNA濃度為0-160μM范圍內發射光譜（λ450nm)，插圖是根據發射光譜數據繪 制的測定酵母RNA(0-40μM)的工作曲線。
[0010] 圖 4 是配合物[Ru(bpy)2(btpp)] (C104)2(6μΜ)的Tris-HCl溶液（5mM，pH= 7. 1) 在酵母RNA濃度為0-150μΜ范圍內發射光譜（λex= 450nm)，插圖是根據發射光譜數據繪 制的測定酵母RNA(0-22μM)的工作曲線。
【具體實施方式】
[0011] 實施例 1 :配合物[Ru(bpy)2(bipp)] (C104)2、[Ru(bpy)2(bopp)] (C104)2和 [Ru(bpy) 2 (btpp) ] (C104) 2的合成
[0012] 配合物[Ru(bpy) 2 (bipp) ] (C104)2、[Ru(bpy) 2 (bopp) ] (C104) 2和[Ru(bpy) 2 (btpp)] (〇104)2按照本課題組已報道的方法[他11，]\1了.；0皿11，2.]\1;他〇,0.;此即，1(.2.丄？1^8· Chem.C2007,111，16577-16585.]合成。
[0013] 配體bipp、bopp和btpp分別通過吡嗪[2,3_f] [1，10]鄰菲略啉-2-羧酸和鄰苯二 胺、2-氨基苯酚和2-氨基苯硫酚按1 : 1的摩爾比在聚磷酸中加熱到200°C發生縮合反應 獲得。反應結束冷卻至室溫后，將混合物在攪拌下倒入400mL冷水中，再用濃氨水調節體系 pH至7。抽濾得到的沉淀，獲得粗產品，再于甲醇中重結晶兩次。bipp，bopp，btpp產率分別 為55%，25%和58%。1^??的氫核磁共振譜數據為：1!1匪1?(500抱，0130-(1 6):5 13.52(8， 1H)，9. 82(s，1H)，9. 81(d，1H)，9. 35(d，J= 8. 0Hz，1H)，9. 22(d，J= 3. 3Hz，1H)，9. 19(d，J =3.lHz，lH)，7.96(dd，J!= 7.7Hz，J2= 4.2Hz，lH)，7.88(dd，J!= 8.0Hz，J2= 4·3Ηζ， 1H)，7. 83 (d，J= 7. 9Hz，1H)，7. 69 (d，J= 7. 7Hz，1H)，7. 38 (t，J= 7. 0Hz，1H)，7. 31 (t，J =7. 1Hz，1H)。bopp和btpp在常見有機溶劑中溶解度都很差，所以沒有進行氫核磁共振 譜表征。配合物[Ru(bpy)2(bipp)] (C104)2、[Ru(bpy)2(bopp)] (C104)2和[Ru(bpy) 2(btpp)] (C104)2的合成過程相同。以配合物[Ru(bpy) 2(bopp)] (C104)2的合成為例進行說明。將[Ru (bpy)2Cl2] ·2Η20(1·lmmol)和bopp(l.Ommol)分音女于 50mL乙酉享/7jC(V/V= 4 : 1)的混合 溶液中，于N2保護下回流6h。反應結束后，旋蒸除去大部分溶劑，再向剩余的液體中逐滴加 入過量4倍的飽和NaC104溶液，得到紅色的高氯酸鹽沉淀。粗產品在硅膠柱上用乙腈/水 /飽和謂0 3溶液以/^ = 60 : 6 : 1)的混合溶液作展開劑進行柱色譜分離提純，最后向 得到的產物溶液中加入飽和NaC104溶液析出沉淀，抽濾所得沉淀，真空干燥得到產品。