一種用于評價三七抗凝活性的生物效價檢定方法
【技術領域】
[0001] 本申請涉及一種用于評價Η走抗凝活性的生物效價檢定方法。
【背景技術】
[000引Η走是一種常用的中藥，其法定來源為五加科植物Η走Panax notoginseng(Burk. )F.Η.化en的干燥根和根莖。又名為田走、山漆、金不換等。支根習稱 "筋條"，根莖習稱"剪口"[5]。Η走始載于《本草綱目》，距今已有400多年的用藥史。在國 內外久負盛名，有"止血神藥"的美稱[12-14]。其性甘、微苦、溫；歸肝、胃經。具有散癒止 血、消腫定痛的功效。臨床上多用于活血、止血。
[0003]《中國藥典》2010年版，在Η走藥材項下主要收載性狀、顯微和薄層鑒別等，難W全 面評價Η走藥材品質，而建立適宜的活血化癒生物活性檢測方法用于Η走質量控制和品質 評價，可W體現Η走藥材功效特點，補充和完善現有的Η走藥材質控模式的不足。
[0004] 將生物活性測定法引入中藥質量控制和評價體現，不僅可W鑒定中藥品種和質 量，而且可W評價藥效，尤其對于Η走等化學成分復雜、理化方法不能表征其含量及理化測 定不能反映生物活性和臨床療效的中藥而言，此方法對于不能反映生物活性和臨床療效的 中藥而言，更能凸顯其優越性。
[0005] 生物評價因具有藥效相關、整體可控等技術優勢，作為符合中醫藥特點的質量標 準控制模式及方法，已成為中藥質量標準化的重要發展方向之一。中藥受品種、產地、加工 方法等諸多因素的影響，造成了中藥質量的物質基礎變化大、質量難W控制的現象，并且其 成分復雜、藥理作用多樣，僅控制少數成分不足W確保藥材或制劑的質量，無法擔任控制質 量或反映療效的重任。因此，本申請試圖通過建立基于生物評價的中藥質量研究的方法，完 善現有的質量控制標準，使臨床用藥更為安全有效。
[000引 參考文獻
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【發明內容】
[0014] 本申請的目的是提供一種用于評價Η走抗凝活性的生物效價檢定方法。
[0015] 中藥質量生物評價方法不等同于一般的藥理學實驗方法，其同時具備定量藥理學 與藥檢分析的雙重屬性和要求。本申請意在用生物效價檢測方法來評價Η走藥材的品質， 從而為其質量控制提供參考依據。一般來說，藥理學實驗方法主要是重現其趨勢和規律，重 在證實試驗結果與對照組比較是否有統計學意義；因此，Η走抗凝指標檢測結果主要是重 現其抗凝活性的趨勢和規律，不一定要重現實驗數據的絕對值，重在證實實驗結果與對照 組比較是否具有顯著性差異及統計學意義；而藥檢分析則要求重現試驗數據的絕對值，但 允許有一定的誤差范圍，因此抗凝活性效價的檢定與化學成分分析方法相比，可從整體上 對Η走藥材的質量進行評價。此外，生物檢定重在評價活性作用大小，而不是要求證某一藥 物是否具有某種藥理作用，更不是要求證其是通過什么藥理機制而發生作用的。
[0016] 具體地，本申請提供一種用于評價Η走抗凝活性的生物效價檢定方法，所述生物 效價檢定方法包括W下步驟：
[0017]a.配制供試品溶液和供試品稀釋液
[0018] 制備Η走藥材樣品的干浸膏；
[0019] 在測定前，用生理鹽水將所述干浸膏配置成供試品溶液，過濾除菌，膽存，優選地 在4Γ下進行膽存，備用；
[0020] 測定時，估計供試品抗凝效價，用所述生理鹽水稀釋所述供試品溶液，得到不同濃 度的供試品稀釋液；
[0021] b.配制對照品溶液和對照品稀釋液
[0022] 用所述生理鹽水將阿司匹林配制成對照品溶液，過濾除菌，膽存，優選地在4°C下 進行膽存，備用；
[0023] 測定時，用所述生理鹽水稀釋所述對照品溶液，得到不同濃度的對照品稀釋液；
[0024] C.測試
[00巧]取凝血儀測試杯，向每個通道加入血漿并加入供試品稀釋液或對照品稀釋液，充 分混勻，預溫后，用全自動凝血儀進行檢測；
[002引 d.生物效價計算
[0027]W所述全自動血凝儀所檢測的凝血酶原時間（PT，單位；S)、活化部分凝血活酶時 間（APTT，單位；S)、凝血酶時間們，單位；S)及纖維蛋白原（FIB，單位；g/L)為評價指標且 對給藥濃度取對數，優選地，W活化部分凝血活酶時間為評價指標，按照2010年版《中國藥 典》生物檢定統計法項下的量反應平行線法（2 · 2)計算Η走樣品的抗凝效價及實驗誤差， 可信限率化％不得超過40 %，優選地不超過30 %。
[0028] 在一些實施方式中，所述干浸膏可W通過W下制備：
[0029] 將Η走藥材樣品粉碎成粗粉，置于圓底燒瓶中，加提取溶劑浸泡，回流提取，抽濾， 減壓回收溶劑，真空干燥，得干浸膏并計算收率；
[0030] 在一些實施方式，所加入的提取溶劑的W毫升計的體積可W為Η走樣品粗粉的W 克計的重量的5-15倍。
[0031] 在一些實施方式中，浸泡時間可W為30分鐘，且可W回流提取兩次，每次1. 5小 時。本領域的技術人員已知的是，浸泡的時間或每次回流的時間可W適當延長或縮短，且回 流的次數可W適當地增加或減少，送樣的調整不會不利地影響方法的準確性。
[0032] 在一些實施方式中，所述提取溶劑可W是體積百分數為75%的己醇、體積百分數 為75%的甲醇或水。
[0033] 在一些實施方式中，所述提取溶劑可W為水，優選地，所述提取溶劑可W為去離子 水。當然，本領域的技術人員將理解的是，在本申請中用作提取溶劑的水還可W為去離子 水、蒸傭水等。
[0034] 在一些實施方式中，在步驟a和步驟b中，可W用0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌。
[0035] 在一些實施方式中，所述供試品溶液的濃度可W為lOmg·ml1，所述對照品溶液的 濃度可W為5mg·mL1。當然，本領域的技術人員將理解的是，所述供試品溶液和對照品溶 液也可W采用其它的濃度，比如20mg·ml1等。
[0036] 在一些實施方式中，用于測試的血漿可W為大鼠血漿、家兔新鮮血漿、兔血凍干血 漿或健康人凍干血漿。
[0037] 在另外的實施方式中，所述血漿還可W為家兔新鮮血漿。
[0038] 在一些實施方式中，所述家兔新鮮血漿可W通過W下制備：
[0039] 取家兔4只，禁食12小時，用一次性采血針自家兔耳緣靜脈取血，迅速注入一次性 構稼酸鋼抗凝管中，充分混勻，30(K)r/min離必15min，分離血漿并置于冰浴中備用。
[0040] 在一些實施方式中，在步驟C中，加入到通道的血漿的體積可W為200μ L ;加入到 通道的供試品稀釋液或對照品稀釋液的體積可W為200μ L ;預溫時間可W為100-200S。當 然，本申請的技術人員將理解的是加入的血漿和供試品稀釋液或對照品稀釋液也可W采用 其它的體積。
[0041] 在一些實施方式中，所述供試品稀釋液的濃度可W為0. 89~5.Omg·血1。
[0042] 在另外的實施方式中，所述供試品稀釋液的濃度可W為1.33mg-mLi和 1. 77mg·mL1。
[004引在一些實施方式中，所述對照品稀釋液的濃度可W為0. 48~2mg·血1。
[0044]在另外的實施方式中，所述對照品稀釋液的濃度可W為0. 75mg·mL1和 1.OOmg·mL1。
[004引其中，本文所給出的供試品溶液或供試品稀釋液的濃度W mg·mL1為單位，其相 當于每毫升溶液中含有的生藥量，比如2. 50mg/ml表示相當于每毫升2. 50毫克生藥量的 溶液。且供試品溶液或供試品稀釋液的濃度是依據W下公式換算的；（稱取的Η走藥材樣 品X收率）^溶液的體積。
[0046] 與現有技術相比，本申請的生物效價檢定方法操作簡單，方便，且能夠從整體上對