一種檢測牛奶中三聚氰胺的化學發光免疫試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種檢測牛奶中Ξ聚氯胺的化學發光免疫試劑盒，用于檢測牛奶中Ξ 聚氯胺的含量。屬于免疫學檢測領域。
【背景技術】
[0002]Ξ聚氯胺（Melamine),化學式CsHeNe，IUPAC命名為：1，3, 5-Ξ嗦-2, 4, 6-Ξ胺，是 一種Ξ嗦類含氮雜環有機化合物，是一種低毒、無味的純白色單斜棱晶體，形似蛋白粉，廣 泛應用于塑料、染料、化肥的生產和紡織工業，含氮量高達66%，且慢性毒性不容易發現，故 經常被人為地添加到食品和動物飼料中W提高N含量，從而造成蛋白質水平虛高。Ξ聚氯 胺本身低毒，但其在酸性或堿性條件下，生成Ξ聚氯酸，Ξ聚氯胺和其共存物Ξ聚氯酸通過 氨鍵在腎臟內形成不溶性結晶，動物實驗結果表明，Ξ聚氯胺的攝入可能會導致繁殖障礙、 膀脫癌、慢性腎炎、腎結石，甚至是膀脫癌，長期攝入高濃度的Ξ聚氯胺，會導致腎衰竭甚至 死亡，特別是對兒童和青少年危害甚大。
[0003] 聯合國負責制定食品安全標準的國際食品法典委員會為牛奶中Ξ聚氯胺含量設 定了新標準，每公斤液態嬰兒牛奶中Ξ聚氯胺含量不得超過0. 15毫克。我國禁止人為添加 Ξ聚氯胺到食品中，嬰兒配方食品中Ξ聚氯胺的限量值為Img/kg，其他食品中Ξ聚氯胺的 限量值為2. 5mg/kg，高于上述限量的食品一律不得銷售。
[0004] 現檢測Ξ聚氯胺的方法主要有：高效液相色譜（HPLC)、液相色譜-質譜/質譜法 (LC-MS/MS法)和氣相色譜-質譜聯用法[包括氣相色譜-質譜法（GC-MS法)，氣相色譜-質 譜/質譜法（GC-MS/MS法）]。
[0005] 高效液相色譜（HPLC)是最常用的檢測方法，具有高效、快速、靈敏度高、假陽性低 等特點，定量限為2mg/kg。但該方法前處理復雜，所需儀器昂貴，操作繁瑣，需要專業技術人 員進行操作，不適合Ξ聚氯胺的快速檢測。
[0006] 液相色譜-質譜/質譜法（LC-MS/MS法)，該方法靈敏度高、假陽性率低等特點，樣 品不需要衍生化處理，可對尿液、血液、肝臟、毛發和眼球樣品進行檢測，定量限為0.Olmg/ kg。但存在檢測儀器造價昂貴，操作步驟繁瑣，對操作人員專業素養要求高等問題，難W滿 足現場快速檢測的要求。
[0007] 氣相色譜-質譜/質譜法（GC-MS/MS法)，靈敏度很高，假陽性率低，定量限為 0.05mg/kg。該方法的主要缺點是樣品需要衍生化運樣復雜的前期處理。雖然經過衍生化 處理的樣品能在質譜中給出更多的結構信息，但是衍生化會產生多個不同的產物并導致樣 品的部分丟失，造成實驗結果的偏差。而且檢測儀器造價昂貴，操作步驟繁瑣，樣本前處理 復雜、耗時，需要專業檢測技術人員進行操作等缺點，無法滿足現場快檢要求。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的在于，針對現有技術不足，提供一種檢測牛奶中Ξ聚氯胺的化學發 光免疫試劑盒，具有快速、靈敏度高、特異性好、重復性好、操作簡便、檢測成本低等優點，從 而滿足現場快速檢測的要求。
[0009] 本發明的另一個目的在于，提供一種牛奶中Ξ聚氯胺的檢測方法，該方法操作簡 單，靈敏度高、特異性好。
[0010] 本發明主要利用抗原與抗體的特異性免疫反應的基本原理來實現。化學發光免疫 分析方法是化學發光法和免疫分析法結合的產物，故其同時具有化學發光法的高靈敏度和 免疫分析法的高特異性。在整個反應過程中，樣品中Ξ聚氯胺含量越高，反應體系中發光強 度越弱；反之，樣品中Ξ聚氯胺含量越少，發光強度越高。
[0011] 本發明一種檢測牛奶中Ξ聚氯胺的化學發光免疫試劑盒，包含W下成份： 包被有抗Ξ聚氯胺抗體的白色不透明96孔可拆卸或不可拆卸的聚苯乙締化學發光 板。
[0012] 應用抑7.0-7. 5 0. 2-0.4%NaN3,0. 2-0. 3mol/L棚酸鹽緩沖液溶液稀釋Ξ聚氯 胺純品，得到的Ξ聚氯胺系列標準品溶液，濃度范圍至少包含了 ： 0.01-0. 81ng/ml的濃度 區間。
[0013] 酶標抗原濃縮液：是由Ξ聚氯胺與牛血清蛋白偶合制成的人工抗原與辣根過氧化 物酶偶聯制備得到。
[0014] 酶標抗原稀釋液：0. 01-0. 02M憐酸鹽緩沖液，pH7. 0-8. 0, 0. 5-1%的牛血清蛋 白。
[0015] 發光底物液。發光底物液分為A、B液。A液為化學發光底物-魯米諾和發光增強 劑-對甲苯酪溶液，B液為過氧化氨脈溶液。
[0016] 濃縮復溶液。濃縮復溶液具體為2倍濃縮憐酸鹽緩沖液，使用前用雙蒸水稀釋至 工作濃度后使用，用于樣品前處理。
[0017] 濃縮洗涂液。濃縮洗涂溶液具體為含有吐溫-20 (Tween-20)緩沖液的20倍濃縮 憐酸鹽緩沖液，使用前用雙蒸水稀釋至工作濃度后使用，用于實驗過程中洗涂化學發光板。 [001引本發明溶液的配制： 本發明試劑盒中設及的Ξ聚氯胺標準品溶液、酶標Ξ聚氯胺抗原溶液、化學發光溶液 及洗涂溶液及其配方對本發明試劑盒檢測的靈敏度影響很大；其中各溶液的主要成分及其 配制方法如下：
[0019] 1、Ξ聚氯胺標準溶液：W常規方法將Ξ聚氯胺純品用抑=7. 0-7. 5 0. 2-0. 4% NaNs, 0. 2-0. 3mol/L棚酸鹽緩沖液配置，濃度分別為：0ng/ml, 0.Olng/ml, 0. 03ng/ml, 0. 09ng/ml, 0. 27ng/ml, 0. 81ng/ml的Ξ聚氯胺標準溶液。
[0019] 2、酶標Ξ聚氯胺抗原溶液：用Ξ聚氯胺與偶聯蛋白偶聯制備的人工抗原與辣根過 氧化物酶偶聯制備得到，將所得酶標Ξ聚氯胺抗原用酶標Ξ聚氯胺稀釋液稀釋成1:4000 的工作濃度。
[0020] 3、酶標抗原稀釋液：0. 01-0. 02Μ憐酸鹽緩沖液，pH7. 0-8. 0, 0. 5-1%的牛血清蛋 白。
[0021] 4、化學發光溶液：A液為魯米諾含量為0. 01M、對甲苯酪含量為0. 001MpH8. 8的 Ξ(徑甲基）氨基甲燒溶液，B液為每100血溶液含巧樣酸2.Ig，無水胞2冊〇4 2. 82g，0. 75% 的過氧化氨脈0. 64mL的水溶液。
[0022] 5、濃縮復溶工作液：胞&口〇4 · 2&0 5. 74邑、胞2冊〇4 · 12&0 32. 6g溶于1L的去離子 水中。
[0023] 6、濃縮洗涂溶液：按體積分數0. 05%將吐溫-20添加至抑7. 4,0.Imol/L憐酸鹽 緩沖液中。
[0024] 7、包被溶液：1. 59g碳酸鋼和2. 53g碳酸氨鋼溶于1L水中，調節抑9. 5。
[002引 8、封閉溶液配制：lOgBSA溶于1L洗涂溶液中，再加入重量比為5%。的Nar^。
[0026] 本發明化學發光板的包被： 本發明中包被化學發光板采用將抗Ξ聚氯胺抗體置于設定的包被溶液中，W設定的濃 度，在37 °C恒溫箱中反應包被。
[0027] 本發明采用的是抑9.5的碳酸鋼-碳酸氨鋼緩沖溶液。本發明中微孔板中所包 被的抗Ξ聚氯胺抗體在堿性環境下可W很好的結合在微孔板塑料表面上，可W經受多次洗 板，采用的抗體包被濃度可W從5mg/m；L-20mg/ml。
[002引包被好的微孔板可W用封閉溶液封閉，封閉液中惰性蛋白優選BSA，需加入Nar燦方 止變質。
[0029] 酶標Ξ聚氯胺抗原溶液的制備： 本發明中酶標Ξ聚氯胺抗原溶液濃度是決定本發明中Ξ聚氯胺酶聯免疫檢測試劑盒 測定范圍及靈敏度的重要因素。
[0030] 本發明中設及的酶標Ξ聚氯胺抗原溶液可W用酶標Ξ聚氯胺稀釋液稀釋成 1:4000的工作濃度。
[0031] 按照上述酶標Ξ聚氯胺抗原溶液濃度制備的試劑盒可W達到很好的線性范圍 (標準線范圍可W達到0. 01-0. 81ng