一種基于拉曼信標分子編碼銀金核殼納米粒子的真菌毒素雙重檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明建立一種基于拉曼信標分子編碼銀@金核殼納米粒子的真菌毒素雙重檢 測方法，屬于材料化學應用領域。
【背景技術】
[0002] 真菌毒素是有害微生物釋放出的有毒次級代謝產物，具有致癌，致突變和肝毒性， 其中髓曲霉毒素和黃曲霉毒素是谷物樣品中最常見的真菌毒素。目前常用的檢測技術主要 包括色譜法、巧光分析和免疫分析等，然而色譜法設備昂貴，需要專業操作人員，且方法耗 時，因此限制了色譜法的應用；巧光信號易受氧氣、濕度和外來物品干擾，影響檢測的準確 性；免疫分析則依賴于抗原抗體特異性親和，抗體分子不穩定，且該方法的實驗操作復雜繁 瑣。相比之下，適配體傳感器具有良好的特異性和簡便的操作性，在真菌毒素的檢測中具有 很大潛力。髓曲霉毒素和黃曲霉毒素適配體已被相繼報道，且對目標分子表現出良好的生 物親和性。盡管適配體傳感器的檢測靈敏度可W達到皮克甚至飛克水平，但大部分仍需要 借助于核酸擴增技術。擴增技術的引入需要額外復雜的操作，同時且會導致假陽性結果，所 W急需建立一種準確、靈敏、無核酸擴增的真菌毒素檢測方法。
[0003] 表面增強拉曼已成為一種靈敏的檢測技術，拉曼納米組裝體已被成功應用于核 酸、癌癥標記物、蛋白質和重金屬離子的檢測。納米組裝體的拉曼信號主要依賴于在兩個或 多個相鄰的金屬納米顆粒間隙的等離子禪合。然而髓曲霉毒素和黃曲霉毒素的適配體長度 較長，會在納米粒子之間產生一個很大的間隙，從而產生微弱的拉曼信號，不利于提高檢測 的靈敏度。而將拉曼信標分子嵌入在核和殼的交界處，則會顯著放大信標分子的拉曼信號， 從而不用精確控制相鄰納米顆粒之間的間隙尺寸。因此制備多重、信號強拉曼編碼粒子可 W實現快速、高通量地真菌毒素檢測。
[0004] 雙金屬等離子的核和殼組成的拉曼編碼粒子表現出獨特的局部表面等離子體共 振效應，和其他納米粒子相比，銀具有最好的等離子增強效應，而金良好的生物相容性可W 作為銀核的外部殼層W防止銀的氧化和毒性，提高了納米粒子的整體穩定性。然而，當銀 核與氯金酸溶液混合時會瞬間發生置換反應，形成中空的金納米粒子或者納米籠。因此本 專利制備兩種拉曼信標分子編碼的銀核金殼實屯、結構納米顆粒，確保了銀核和金殼間較強 等離子禪合作用，大大提高拉曼信標分子的拉曼信號，應用于髓曲霉毒素和黃曲霉毒素超 靈敏的雙重檢測。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種基于拉曼信標分子編碼銀@金核殼結構納米粒子的真 菌毒素雙重檢測方法。
[0006] 本發明的技術方案包括：拉曼信標分子編碼銀@金核殼納米粒子的制備及表征， 雙重檢測拉曼傳感器的構建W及在黃曲霉毒素和髓曲霉毒素的特異性分析檢測。
[0007] 具體步驟：
[0008] (1)拉曼信標分子編碼銀@金核殼納米粒子的制備
[0009] 采用棚氨化鋼還原法制備粒徑大小為lOnm的銀納米粒子，在已合成的銀納米粒 子表面修飾拉曼信標分子，然后進行一層金殼的生長，通過調控緩沖體系的抑和拉曼信標 分子的種類制備不同拉曼信標分子編碼的銀@金核殼納米粒子。
[0010] (2)雙重檢測拉曼傳感器的構建
[0011] 在已制備的兩種不同種類的拉曼信標分子編碼銀@金核殼納米粒子分別修飾表 面分別修飾黃曲霉毒素和髓曲霉毒素的核酸適配體。參照專利化2009 1 0182031. 2合成 粒徑大小在240nm左右磁性納米粒子，在其表面修飾黃曲霉毒素和髓曲霉毒素核酸適配體 的互補核酸片段。通過核酸雜交互補配對原則，拉曼信標分子編碼銀@金核殼納米粒子組 裝在磁納米粒子周圍，該結構表現出較強的拉曼信號。
[0012] (3)黃曲霉毒素和髓曲霉毒素的特異性分析檢測
[0013] 在已構建好的雙重檢測拉曼傳感體系中加入不同濃度的黃曲霉毒素和髓曲霉毒 素，相應的銀@金核殼納米粒子表面的核酸適配體和目標分子識別，使得對應的拉曼分子 編碼銀@金核殼納米粒子從磁性納米粒子表面脫落，通過磁分離，組裝體的拉曼信號減弱， 建立組裝體拉曼信號強度和對應真菌毒素濃度間的標準曲線。
[0014] 本發明的有益效果：本發明提供一種簡便、可控的方法制備多種拉曼信標分子編 碼銀@金核殼納米粒子，構建新型多重拉曼傳感檢測器，實現兩種甚至多種真菌毒素的同 時、快速、特異性檢測。
【附圖說明】
[0015] 圖1拉曼信標分子編碼銀@金核殼納米粒子的透射電子顯微鏡照片
[0016] 圖2兩種拉曼信標分子編碼銀@金核殼納米粒子的拉曼圖譜
[0017] 圖3磁納米粒子-拉曼信標分子編碼銀@金納米粒子的核-衛星狀組裝體的透射 電子顯微鏡照片
[0018] 圖4不同濃度黃曲霉毒素和髓曲霉毒素下納米組裝體的拉曼圖
【具體實施方式】[001引實施例1
[0020] (1)對氨基苯硫酪編碼銀@金核殼納米粒子的制備
[0021] 采用棚氨化鋼還原法制備粒徑大小為lOnm的銀納米粒子，取2mL的銀納米粒子W 8000轉每分鐘的速度離屯、lOmin，去除上清液，將沉淀重懸在200μL超純水中。取100μL 的銀納米粒子，加入2μL100μΜ對氨基苯硫酪，使其終濃度為2μΜ。在室溫下反應12h，W 8000轉每分鐘的速度離屯、lOmin，去除未修飾的對氨基苯硫酪，將沉淀重懸在100μL超純 水中。
[002引取新鮮配置的100μLlOOmM的巧樣酸溶液加入到1血質量分數為1 %的聚乙締 化咯燒酬溶液，混合均勻。用濃度200mM的氨氧化鋼溶液調節溶液pH為9. 5,然后將50μL 對氨基苯硫酪修飾的銀納米粒子和100μL濃度為2mM的氯金酸溶液加入到上述溶液中，室 溫反應化，離屯、去除上清液，將沉淀分散在50μL的超純水中，即制備好的對氨基苯硫酪編 碼銀@金核殼納米粒子。
[0023] (2)對硝基苯硫酪編碼銀@金核殼納米粒子的制備
[0024] 采用棚氨化鋼還原法制備粒徑大小為lOnm的銀納米粒子，取2mL的銀納米粒子W 8000轉每分鐘的速度離屯、lOmin，去除上清液，將沉淀重懸在200μL超純水中。取100μL 的銀納米粒子，加入2μL100μΜ對硝基苯硫酪，使其終濃度為2μΜ。在室溫反應12h，W 8000轉每分鐘的速度離屯、lOmin，去除未修飾的對硝基苯硫酪，將沉淀重懸在100μL超純 水中。
[002引取新鮮配置的100μLlOOmM的巧樣酸溶液加入到1血質量分數為1 %的聚乙締 化咯燒酬溶液，混合均勻。用濃度200mM的氨氧化鋼溶液調節溶液pH為9. 5,然后將50μL 對硝基苯硫酪修飾的銀納米粒子和100μL濃度為2mM的氯金酸溶液加入到上述溶液中，室 溫反應3h，離屯、去除上清液，將沉淀分散在50μL的超純水中，即制備好的對硝基苯硫酪編 碼銀@金核殼納米粒子。
[0026] (3)拉曼信標分子編碼銀@金核殼納米粒子的表面修飾
[0027] 取50μL200ηΜ已制備的對氨基苯硫酪編碼銀@金核殼納米粒子分散在500μL Tris-棚酸溶液中，加入5μL10μΜ髓曲霉毒素核酸適配體，反應1化后，將溶液W8000轉 每分鐘的速度離屯、lOmin，去除上清液，將沉淀重懸在50μL超純水中。
[0028] 取50μL200ηΜ已制備的對硝基苯硫酪編碼銀@金核殼納米粒子分散在500μL Tris-棚酸溶液中，加入5μL10μΜ黃曲霉毒素核酸適配體，反應1化后，將溶液W8000轉 每分鐘的速度離屯、lOmin，去除上清液，將沉淀重懸在50μL超純水中。
[0029] (4)雙重檢測拉曼傳感器的構建
[0030] 參照專利化200910182031. 2合成粒徑大小在240皿左右簇基化的磁性納米粒 子。取100μL500ηΜ磁性納米粒子加入50μL100μΜ1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳 二亞胺鹽酸鹽溶液和50μL10μΜN-徑基班巧酷亞胺溶液，室溫下解育過夜。取10μL 500ηΜ已活化好的磁性納米粒子加入到1血抑7. 4憐酸鹽緩沖溶液中，混合均勻，加入 2. 5μL100μΜ黃曲霉毒素核酸適配體的互補片段和2.5μL100μΜ髓曲霉毒素核酸適配 體的互補片段，混合物于室溫下震蕩反應lOh，磁分離，用乙醇洗涂Ξ次，將沉淀重懸在超純 水中。
[0031] 取20μLlOnM已修飾好核酸片段的磁性納米粒子、20μL200nM髓曲霉毒素核酸 適配體修飾的對氨基苯硫酪編碼銀@金核殼納米粒子、20μL200nM黃曲霉毒素核酸適配 體修飾的對硝基苯硫酪編碼銀@金核殼納米粒子加入到100μLTris-鹽酸緩沖溶液中，在 40°C下解育化，通過DNA雜交互補配對原則，