用于確定癌癥預后的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及用于確定受試者中癌癥預后的方法、診斷組合物和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 在大部分工業化國家中，癌癥是死亡的主要原因，并且癌癥死亡的直接原因通常 是其向生命器官的轉移。在Japan，結直腸癌是第三大常見癌癥原因，每年每100, 000名人 口中診斷出~100名新結直腸癌患者，并且死亡率是30 - 40名/100, 000名患者；并且這仍 然在增長。
[0003] 癌癥治療，諸如化療和射線，具有相關的風險，并且，最佳選擇更可能得益的患者 是重要的。盡管有一些關于結直腸癌的預后標記物的研究（非專利文獻1-7)，但是，其不足 以鑒定具有良好的預后的患者，對于這樣的患者，將不需要危險性的治療。
[0004] 引用列表
[0005] 非專利文件
[0006] 非專利文件 I :Science (科學）314 :268-274 (2006)
[0007] 非專利文件 2 :Science (科學）318 :1108-1113(2007)
[0008] 非專利文件 3 :NEJM 344 :1196-1206(2001)
[0009] 非專利文件 4 :Clin. Cancer Res.(臨床癌癥研究）17 :1535-1545(2011)
[0010] 非專利文件 5 J. Clin. Oncol.(臨床腫瘤學）29 :17-24(2011)
[0011] 非專利文件 6 J. Clin. Oncol.(臨床腫瘤學）29 :1261-1270(2011)
[0012] 非專利文件 7 J. Clin. Oncol.(臨床腫瘤學）29 :4620-4626(2011)
[0013] 這些參考文獻通過引用結合在本文中。
[0014] 發明概述
[0015] 在研究癌癥轉移的機制時，我們證明Notch受體裂解起始DABl-ABL激活并且引起 TRIO的Tyr-磷酸化。此外，我們發現TRIO在Y2681處的磷酸化與CRC患者差的預后相關 (圖6A)，并且TRIO (pY2681)不僅在原發性CRC中發出信號，而且還在其轉移和包括乳腺癌 和肺癌在內的多種其他類型的癌癥中發出信號（圖12和表2)。基于這些發現，我們完成了 本發明。
[0016] 在一個實施方案中，本發明提供用于確定受試者中的癌癥預后的方法，所述方法 包括以下步驟：在從所述受試者獲得的樣品中檢測TRIO的2681位處的酪氨酸殘基的磷酸 化，其中不存在磷酸化表示良好的癌癥預后。
[0017] 在另一個實施方案中，本發明提供特異性結合TRIO(PY2681)的抗體。
[0018] 在另一個實施方案中，本發明提供用于確定癌癥預后的診斷組合物，所述診斷組 合物包含本發明的抗體。
[0019] 在另一個實施方案中，本發明提供用于確定癌癥預后的試劑盒，所述試劑盒包括 本發明的抗體。
[0020] 在另一個實施方案中，本發明提供用于治療結直腸癌的藥物組合物，所述藥物組 合物包含ABL抑制劑。
[0021] 在另一個實施方案中，本發明提供用于防止癌癥轉移的藥物組合物，所述藥物組 合物包含ABL抑制劑。
[0022] 附圖簡述
[0023] 圖I. Notch信號傳導（signaling)激活CRC細胞中的Rho從而刺激侵入
[0024] (A和B)Rbpj基因敲除阻斷Apc/Aes復合突變體小鼠中腸腫瘤的侵入。在Apc/ Aes雙重和Apc/Aes/Rbpj三重突變體小鼠的腸中通過H&E染色（A)以組織病理學方式分析 腫瘤侵入的深度并評分（B)。對于每組，η = 5。（A)中的虛線表示粘膜肌層（muscularis mucosae)的位置。（A)中的星號顯示侵入到粘膜下層的CRC腺體。（B)中的侵入深度由粘 膜內層（Mu)和到達粘膜下層（Sm)、固有肌層（MP)和漿膜（Se)的縮寫顯示。參見基因型縮 寫的實驗規程。
[0025] (C) Apc/Aes小鼠的侵入的腸腫瘤中的Rho的激活。在GTP-Rho拉下測定 (pull-down assay)中，分析來自Apc+/A716對照（Apc)和Apc/Aes突變體小鼠的正常的腸 粘膜（N)和腫瘤⑴的組織。還顯示了總Rho蛋白的量。
[0026] (D)通過Aes的Rho激活的抑制。將Colon26 TetON-Aes-Flag細胞鋪板到包被有 重組的DLL4(rDLL4)的胞外結構域的培養皿上，并且通過多西環素（doxycycline)誘導有 Flag-標記的Aes (Aes-F)。刮下后16小時收集細胞層，并且分析GTP-Rho。
[0027] (E和F)抑制Rho或Rock抑制培養物中的CRC細胞的基質膠侵入和透內皮迀移 (TEM)。分別在存在兩個劑量的Rho抑制劑C3T或Rock抑制劑Y-27632的情況下，測定RKO 人CRC細胞的基質膠侵入（E)或TEM(F)。
[0028] (G和H)在用EDTA處理的人CRC細胞中通過Notch受體激活的Rho激活的時程。 將RKO細胞用IOmM EDTA處理2分鐘，并且在標準培養基中培養指定時間，并測定GTP-Rho。
[0029] (I)通過Notch受體經由其配體的激活來激活Rho。將RKO細胞鋪板在包被有 rDLL4的培養皿上，并且在指定時間點收集用于GTP-Rho拉下測定。
[0030] (J)在CRC細胞中通過敲低三個Notch受體種內同源基因減少Rho激活。將RKO 細胞用針對Notchl、2和3的siRNA(siNotchl/2/3)的混合物（對于每種種內同源基因，#1 和#2)轉染。非沉默SiRNA(Ns)和無轉染（-)用作對照。轉染后48小時，將細胞用或不 用IOmM EDTA處理并且分析GTP-Rho。
[0031] (K)通過γ -分泌酶抑制Notch受體激活而抑制Rho激活。將RKO細胞用10 μ M DAPT處理12小時，用IOmM EDTA處理，并進行Rho拉下測定。
[0032] 刻度條，100μπι。數據表示為平均值與SD。*ρ〈0·01，并且#ρ〈0·05。對于GTP-Rho 拉下測定，還測定總Rho蛋白的量。還參見圖S1。
[0033] 圖2. Rbp j-依賴性和-不依賴性Notch信號傳導對于CRC進展都是關鍵的。
[0034] 通過Notch受體激活的早期（A-D)和晚期（E-J)反應。
[0035] ㈧Notch和Rho對于CRC細胞與內皮細胞（EC)的附著是關鍵的。將表達EGFP的 HCT116細胞用或不用C3T或DAPT處理2小時，并且鋪板到肺內皮細胞（LgEC)層上。15分 鐘后，將未結合的HCT116細胞清洗掉，并且通過熒光計計數保持附著的細胞數目。
[0036] (B和C) Rho的早期激活不依賴于RBPJ。通過轉導兩個用于非沉默對照（Ns)的表 達載體或者RBPJ-敲低（shRBPJ)短發夾RNA構建體建立HCTl 16細胞的穩定的克隆系（B)。 在2分鐘的EDTA處理后，使它們進行Rho拉下測定（C)。
[0037] (D)甚至在不存在RBPJ時，CRC細胞與EC的附著也取決于γ -分泌酶活性。將 (B)中所述的RBPJ-敲低或對照細胞用或不用DAPT處理2小時，并且進行（A)中的附著測 定。
[0038] (E) RBPJ對于Rho的晚期激活是關鍵的。將RBPJ-敲低或對照細胞用EDTA處理， 并且在6或12小時測定GTP-Rho。
[0039] (F)小鼠和果蠅共有的Rbpj靶向基因。如通過RNA-seq和使用抗-Rbpj Ab的染色 質免疫沉淀（ChlP)-seq確定的，在小鼠腦中，98個基因由Rbpj直接調節。另一方面，在果 蠅中，55個基因通過Notch信號傳導上調，其鄰近的區域被Su(H)結合，Su (H)是小鼠 Rbpj 的果蠅直向同系物。顯示的是在兩個物種之間通過Rbpj共同表達的共有的3個基因家族； 小鼠和（果蠅）基因符號。
[0040] (G)果蠅、小鼠和人dab/Dabl/DABl啟動子區中發現的Notch轉錄因子SuOl)/ Rbpj/CBFl的高親和性結合基序。高親和性和低親和性序列基序分別由實心三角和空心三 角顯示。用于ChIP分析的引物對（圖21，右側）由一對水平的三角形表示。TSS是轉錄起 始位點。
[0041] (H)重組DLL4(rDLL4)配體在培養的CRC細胞中誘導DAB1。將LS174T細胞用或 不用10 μ M DAPT溫育24小時，并且鋪板在用或不用rDLL4預先包被的培養皿上。四小時 后，通過定量（q) RT-PCR定量DABl mRNA水平。
[0042] (I) RBPJ結合DABl啟動子。用抗-Rbpj或抗-NICD對LS174T裂解物進行的ChIP 富集DABl基因的基因組啟動子片段，如由qPCR確定的。
[0043] (J)在Apc/Aes小鼠 CRC中誘導Dabl。在Apc和Apc/Aes突變體小鼠的腫瘤中， Dabl用淺灰色染色，而細胞核用深灰色染色。框出的區域在右圖中放大。符號同圖ΙΑ。T， 腫瘤。S，間質。
[0044] 刻度條，50μπι。數據表示為平均值與SD。*ρ〈0·01。還參見圖9。
[0045] 圖3. DABl通過Rho激活刺激CRC侵入和轉移
[0046] (Α和Β) Dabl對于內源性CRC的進展是關鍵的。將腸上皮-特異性的Dabl空突變 引入到Apc/Aes雙重突變體小鼠中以得到Apc/Aes/Dabl三重突變體小鼠。使用與圖IA和 IB相同的方法和符號。
[0047] (C，D和E)敲低DABl抑制CRC移植物的轉移。用編碼EGFP的表達載體和針對 DABl的shRNA(shDABl)轉導高DABl的LS174T細胞（C)。建立兩個克隆系，并且注射到裸 鼠直腸中。在熒光解剖顯微鏡下評估它們的肺轉移（D)，并對其數目進行評分（E)。
[0048] (F，G和H) DABl的表達在體內刺激CRC轉移。用EGFP和DABl的表達載體轉導低 DABl的RKO細胞（F)，并且植入裸鼠直腸粘膜中。分別進行如在⑶和（E)中那樣的評估 (G)和定量⑶。
[0049] (I)DABl對于通過Notch信號傳導的Rho的早期和晚期激活都是關鍵的。將 DABl-敲低或對照克隆用IOmM EDTA處理，并且在所示的時間進行Rho拉下測定。
[0050] (J)通過Notch受體分解和DABl的Rho的協同性激活。將表達DABl的RKO細胞 用或不用m)TA處理2分鐘，并在5分鐘后進行Rho拉下測定。
[0051] (K)EDTA處理后，DABl的RBPJ-依賴性誘導。將RBPJ-敲低（shRBPJ ;紅色）或對 照（Ns ;黑色）HCT116細胞用EDTA處理，并且在指定的時間針對DABl mRNA進行qRT-PCR測 定。
[0052] 刻度條對于（A)為100 μ m，對于（D)和（G)為500 μ m。數據表示為平均值與SD。 *口〈0.01，并且#?〈0.05。
[0053] 圖4. DABl和ABL的酪氨酸磷酸化本身對于Rho激活和CRC細胞侵入是必要的
[0054] (A和B)伊馬替尼（Imatinib)抑制內源性CRC的侵入。將Apc/Aes復合突變體小 鼠用（紅色）或不用（灰色）50mg/kg/天的伊馬替尼處理9周（各η = 5)。使用與圖IA 和IB相同的方法和符號。
[0055] (C)在人CRC細胞中敲低ABL抑制基質膠侵入。將RKO細胞分別用針對 ABLl(siABLl)、ABL2(siABL2)的兩個獨立的siRNA組（#1和#2)或它們的組合轉導。轉染 后48小時，通過qRT-PCR定量ABLl和ABL2的表達（下部）。同時，檢測細胞的基質膠侵入 (上部）。
[0056] (D)ABL敲低減少由Notch信號傳導引發的Rho激活。在EDTA處理5分鐘后，在 RKO細胞中檢測兩組組合的敲低對Rho的抑制作用。
[0057] (E) ABL抑制劑伊馬替尼以劑量依賴性方式阻斷CRC細胞的基質膠侵入。用伊馬替 尼處理RKO細胞，并檢測基質膠侵入。
[0058] (F)伊馬替尼抑制由Notch受體激活誘導的Rho激活。在不存在或存在伊馬替尼 的條件下，將RKO細胞用EDTA處理，并在5分鐘后進行Rho拉下測定。
[0059] (G)DABl增加 CRC細胞中ABL的Tyr-激酶活性。第1-3道；HCTl 16細胞表達等 量的Flag-標記的野生型DABl (第2道）或其5YF突變體（第3道），并且，在免疫沉淀 (IP)后通過蛋白質印跡（WB)確定其磷酸-Tyr(pY)含量。第4-7道；HCT116細胞共表達 DABl-Flag 和 HA-標記的野生型（WT)ABLlB (ABLlB-HA)。注意，在第 6 和 7 道中 DABl-Flag cDNA的輸入量分別與在第2和3道中的輸入量相等。第8 - 11道；HCT116共表達與第4-7 道中相同組的DABlcDNA和ABLlB的激酶-死亡（KD)突變體。
[0060] 數據表示為平均值與SD。*ρ〈0·01。還參見圖10。
[0061] 圖5. TRIO在ABL和DABl的存在下Tyr-磷酸化，并且刺激CRC侵入
[0062] (A)TRIO 結構域結構（由（Bateman，J.和 Vactor，D. V.，2001，J. Cell Sci. 114:1973-1980)修改）和可磷酸化的Tyr殘基的示意圖。上部顯示包含3097個aa的 野生型人TRIO (TRIO WT)的結構域。矩形顯示所示的具體結構域。縮寫：GEF，鳥嘌呤核苷 酸交換因子結構域；Ig，免疫球蛋白樣結構域；STK，絲氨酸-蘇氨酸激酶結構域。在TRIO WT 結構下方，Tyr(Y)至Phe(F)突變的位置以紅色"F"顯示。Ig結構域中的星形表示G2699， 在人肺癌中發現其錯義突變為Val (見圖7F和7G)。
[0063] (B和C) TRIO敲低抑制CRC細胞中由Notch信號傳導誘導的Rho激活和基質膠侵 入。將HCTl 16細胞用兩個獨立的針對TRIO mRNA的siRNA構建體（siTRI0#l或2)轉染。 48小時溫育后，將細胞用或不用EDTA處理，并且測定GTP-Rho(B)和基質膠侵入（C)。
[0064] (D)在CRC細胞中，TRIO在ABL和DABl的存在下Tyr-磷酸化。將HCTl 16細 胞用或不用針對T7-標記的TRI0(T7-TRI0)的表達構建體轉導，用或不用HA-標記的 ABLlB (ABLlB-HA)和/或Flag-標記的DABl (DABl-Flag)共轉導。使用與圖4G相同的符 號。
[0065] (E) TRIO的C端半被ABL磷酸化。T7-TRI0的WT或YF突變體與或不與ABLlB-HA 和DABl-Flag同時表達，然后蛋白質印跡分析pYs。
[0066] (F)在ABL和DABl存在下，TRIO中的Y1990和Y2681被磷酸化。注意，在Y1990F 和Y2681F突變體（第2和4道）以及在4YFs (第6道）中，pY水平顯著減少。
[0067] 數據表示為平均值與SD。*ρ〈0·01。
[0068] 圖6.人CRC中TRIO (Υ2681)的磷酸化與差的預后相關。
[0069] (A)TRI0(pY2681)與CRC患者中差的預后相關。通過免疫組織化學檢驗來自102 名患者的原發性CRC樣品的TRIO(pY2681)，然后進行Kaplan-Meier分析。（左）當合并 所有階段的患者時，32個病例是TRI0(pY2681)免疫染色陰性的（-)，而70個病例是陽性 的（+)。（_)相對（+)，在卡方檢驗中，P = 0.01。（中）對于合并的I期和II期患者， TRIO(pY2681)-陰性組表現出100%的5年存活，TRIO(pY2681)-陽性組表現出~20%的死 亡率。（ -)(η = 23)相對（+) (η = 40)，在卡方檢驗中，p = 0· 04。（右）甚至僅對于II期 患者，與陽性患者（η = 33)相比，陰性患者（η = 13)具有100%的存活，表現出與合并的I 期和II期相似的存活率（在卡方檢驗中，P = 〇. 1)。
[0070] (B) CRC細胞（箭頭）中針對TRIO (PY2681)的染色強于在相鄰的正常粘膜（N)或 淋巴樣濾泡（L)中的染色。框出的區域在插入的圖表中放大表示。
[0071] (C，D和E)在侵入的間質中發現的CRC細胞中的TRI0(pY2681)的染色。注意，在 出芽的（D)和分散的（E)CRC細胞（箭頭）中，TRI0(Y2681)被高度磷酸化。
[0072] 刻度條，100 μπι。還參見圖11。
[0073] 圖7. TRIO (Υ2681)的磷酸化刺激RhoGEF活性并且促進CRC細胞的侵入。
[0074] (A)人CRC中核AES與TRIO(ρΥ2681)的逆相關。顯示的是用抗-AES和 抗-TRIO (ρΥ2681)抗體免疫染色的兩個代表性的系列切片組。注意，表達核AES的CRC腺 體具有很少的TRI0(pY2681)染色（箭頭；頂部行），而TRI0(pY2681)_陽性CRC腺體沒有 AES表達（箭頭；底端行）。插圖顯示更高放大率的框出區域。
[0075] (B)在小鼠腸腫瘤中通過失去Aes的Trio在Y2681處的磷酸化。通過IP-WB分析 正常粘膜（N)和腸腫瘤⑴的裂解物的Trio (pY2681)。還顯示了總Trio印跡（Trio)。
[0076] (C)TRIO(WT)而不是TRI0(Y2681F)刺激在基質膠中的CRC侵入。構建克隆的 RKO TetON細胞系以多西環素（Dox)-可誘導的方式同時表達ABL1B-HA/DAB1-Flag與 T7-TRI0 (WT)或T7-TRI0 (Y2681F)，并且測定蛋白表達和基質膠侵入。
[0077] (D)不含細胞的RhoGEF GTP交換測定。表達TRIO(WT)蛋白，免疫沉淀，并且與重 組RhoA和mant-GTP混合，mant-GTP在其與Rho結合時發出熒光。三次測定的代表性結果。
[0078] (E)TRI0(pY2681)對RhoGEF活性是關鍵的。純化T7-標記的TRI0(WT或Y2681F)， 并且確定其RhoGEF活性10分鐘。TRIO[ima];從伊馬替尼處理的HEK293T細胞純化的TRIO 蛋白。
[0079] (F)TRI0(G2699V)刺激RhoGEF活性。純化WT和G2699V突變體TRI0,并且如在 (E)中那樣測定其RhoGEF活性。
[0080] (G)TRI0(G2699V)對 Y2681 處的 Tyr-磷酸化更敏感。WT 或 G2