基于量子點多級檢測腫瘤標記物傳感器及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于納米材料制備和免疫組化技術交叉領域，涉及一種傳感器及其制作方 法尤其是一種量子點結合免疫探針檢測自身免疫病生物標記物的光學傳感器及其制備方 法，應用于檢測和監控自身免疫疾病技術領域。
【背景技術】
[0002] 量子點與傳統的突光染料相比，具有以下優點：（1)光穩定性好、耐漂白、熒光強 度約為羅丹明6G的20倍，穩定性約為它的100倍；（2)激發光譜范圍寬并且可以實現多組 分同時激發；（3)發射光譜半峰寬比較窄、峰形尖銳、對稱性好及發光光譜可調性，可調波 長范圍為400-2000mn，覆蓋了紫外到近紅外區域；(4)熒光壽命較長；（5)顏色具有多樣 性，不同粒徑的量子點顏色也不同；(6)檢測便利性，對檢測儀器的要求不是很高；（7)量 子產率高、斯托克位移較大等。因此量子點廣泛應用在生物傳感、突光探針標記及檢測、分 子診斷、靶向治療、生物成像和生物分析等方面。
[0003] 生物傳感利用量子點作為一個平臺，根據調節量子點的熒光強度（而不是改變量 子點的數量）為組裝生物探針提供一種信號轉換。雖然人們對CT傳感越來越有興趣，但是 調整量子點熒光強度最常見也許是最具特色的機制仍是熒光共振能量轉移，量子點是突光 共振能量轉移理想的供體，當遇到合適的供體時也能變成極好的受體。因此，量子點在FRET 傳感器方面獲得了極大的發展。
[0004] 自從1998年《Science》上報道了可將生物大分子偶聯到量子點的表面之后，科 學研究者對量子點標記生物分子越來越感興趣。最近十年這個領域的研究更集中于低毒 性，高生物親和性的量子點的合成及生物醫學應用。
[0005] 19世紀末，大多數學者認為，免疫現象只是機體對外界傳染因子的入侵而發生的 防御反應，而對人體自身組織成分不產生抗體，稱之為免疫耐受。隨著科學發展，科學家發 現有一類疾病是由于機體對自身抗原的耐受失去時，免疫系統對自身抗原發起攻擊進而引 起組織或器官造成的損害，這類疾病被稱為自身免疫病。抗原性質變異、交叉免疫反應、遺 傳因素和病毒因素都會引起機體的自身抗原耐受失去。
[0006] 對于自身免疫病的國際通用診斷標準主要依靠臨床癥狀及實驗室對血清中自身 抗體抗原的評估，尤其是通過患者血清內的一種或幾種生物標記物水平表征。生物標志物 可用來反映自身免疫病的發病機制，并用于疾病的診斷、監測、分層和預測個人對治療的反 應。長期以來，抗dsDNA抗體、補體活性和免疫復合物等免疫學指標是自身免疫病活動性的 經典標志。隨著技術的進步和研究的深入，大量新相關生物標志物出現。
[0007] 生物芯片、蛋白微陣列技術是20世紀末期產生的高通量平行檢測技術，它一經產 生就顯示了極大的優勢，寡核苷酸微陣列已經在基因表達和人類疾病的研究中取得了廣泛 的成果。而蛋白質微陣列近年來也發展迅速.已經應用于TORCH感染病原體和過敏原的檢 測。目前，自身抗體抗原及其類似物的檢測手段主要是western blotting和ELISA (酶聯 免疫吸附）等，但這些手段無一例外都擁有繁瑣的制備過程，又由于需要相對大量的試劑和 臨床標本而受到限制，并不能進行多級檢測。
【發明內容】
[0008] 針對目前自身免疫病檢測的技術問題，本發明的目的在于克服已有技術存在的不 足，采用新的檢測體系，提供一種基于量子點熒光共振能量轉移（FRET)多級檢測自身免疫 疾病生物標記物的方法。提高相關疾病生物標記物檢測的靈敏度、精確度，與其他檢測方法 相比，有更為靈敏的檢測效果，大大降低最低檢測濃度和檢出限，并且可以進行多級檢測， 對具有多種生物標記物的自身免疫病的檢測更具有應用價值。
[0009] 為達到上述目的，本發明采取如下技術方案：基于量子點多級檢測腫瘤標記物傳 感器，基于量子點熒光共振能量轉移（FRET)檢測自身免疫病生物標記物體系由玻璃基底、 QDs-Ag復合物為免疫探針、二抗-DNA-Au NPs復合物為識別生物標記物的探針構成體 系。玻璃基底經過硅烷化試劑進行硅烷化修飾，在生物交聯劑作用下作為攜帶熒光信號的 QDs-Ag復合物的承載體。而二抗-DNA-Au NPs復合物中的Au NPs作為熒光共振能量轉移 (FRET)的能量受體，接受與其接近的QDs-Ag復合物提供的能量供給，從而形成熒光信號的 變化。二抗-DNA-Au NPs通過生物交聯劑結合二抗、長鏈DNA及均一尺寸金納米顆粒構成， 經過免疫結合過程連接到體系之中。
[0010] 基于量子點多級檢測腫瘤標記物傳感器，該傳感器包括：利用量子點偶聯抗原形 成QDs-Ag復合物作為免疫探針，負載玻璃基底和識別生物標記物的探針，所述探針為二 抗-DNA-Au NPs復合物。進一步，所述量子點同抗原偶聯方法有：雙功能蛋白或生物素-親 和素介導非共價結合偶聯法；氨基同羧基、氨基與巰基及醛基和酰肼共價結合方法。
[0011] 本發明的另一目的是提供一種制備上述傳感器的方法，該方法包括以下步驟： 步驟1)、CdTe-ZnS核殼量子點的合成； 步驟2) QDs-Ag復合物的合成及負載； 步驟3)二抗-DNA-Au NPs復合物的合成； 進一步，所述步驟1的核殼量子點合成，具體步驟如下： 步驟1. 1 :配制亞碲酸鉀溶液作為碲前體，水合乙酸鎘提供鎘源，按比例加入巰基丙酸 作為包被液，三者之間濃度比為I :2 :1. 7 ;調節體系pH在10-11，在溫度為100°C下，加熱回 流 1-10 h，得到 CdTe QDs ; 步驟1. 2 :取步驟1得到CdTe QDs加入二水合乙酸鋅和硫化鈉的混合物中，二水合乙 酸鋅和硫化鈉的比例為2 :1，以巰基丙酸溶液為包被液，三者之間濃度比為I :2 :1. 7 ;重新 調節體系的pH為10-11，采用高溫水熱法最終合成最終得到發射峰為550 nm-676 nm的 CdTe-ZnS核殼量子點。
[0012] 進一步，所述步驟2的具體步驟如下： 步驟：2. 1 :將合成的CdTe-ZnS核殼量子點通過的交聯劑的作用，活化CdTe-ZnS核殼 量子點表面的羧基，同自身免疫抗原（Ag)上的氨基結合，形成QDs-Ag復合物，超速離心除 去未連接的CdTe-ZnS核殼量子點和自身免疫抗原（Ag); 步驟2. 2 :利用濃度為25%氫氧化鈉溶液對玻璃片進行浸泡處理30 min，使玻璃基片表 面羥基化，再通過硅烷偶聯劑3-氨丙基-三乙氧基硅烷的浸泡使得玻璃片硅烷化；將步驟 2. 1得到的QDs-Ag復合物負載于硅烷化后的玻璃基底上，在溫度為4°C下放置過夜，完成 負載。
[0013] 進一步，所述二抗-DNA-Au NPs復合物的合成的步驟如下： 利用交聯劑將免疫球蛋白（IgG)和二抗同3 '修飾氨基的DNA雙鏈結合，免疫球蛋白 (IgG)和二抗同3 '修飾氨基的DNA雙鏈的濃度配比為3 :1，形成二抗-DNA復合物，色譜 純化后再利用DNA 5'端修飾的巰基同Au NPs形成配位鍵，兩種濃度比為1:2. 5,構成二 抗-DNA-Au NPs復合物，對所述二抗-DNA-Au NPs復合物使用色譜法進行純化。
[0014] 進一步，所述步驟2.1中的交聯劑為EDC(1-乙基-3-[3_二甲基氨基丙基]碳化 二亞胺鹽酸化物）和NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)，二者之間的質量比為4 :1。
[0015] 4)熒光強度變化表征目標物濃度。
[0016] 通過標準溶液檢測，得出不同QDs-Ag復合物熒光淬滅即熒光強度減小量與標準 液濃度的關系式，利用關系式在實際檢測中得出目標物濃度。能夠同時進行多種自身免疫 疾病生物標記物的檢測，是本發明的主要創新點。
[0017] 利用納米熒光分子作為能量受體接近QDs-Ag復合物，產生熒光共振能量轉移 (FRET)。納米熒光分子可以是諸如CdTe、CdSn/ZnS等不同類型的量子點；可以是以聚苯乙 烯、聚甲基丙烯酸酯類、聚丙烯酰胺類為微粒主體，表面鍵合或吸附熒光素、菁色素等熒光 物質的熒光納米微球；也可以是金、銀納米顆粒等具有熒光性質的貴金屬納米顆粒。這一部 分的是在那個步驟中處理的？（此部分屬于熒光淬滅部分，所涉及的是