一種免固定生物傳感電極的制備及其在免標記均相光致電化學農殘檢測與癌癥診斷中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種可特異性地吸附單鏈DNA而不吸附雙鏈DNA的免固定生物傳感電極的制備及其免標記均相光致電化學分析方法的應用。通過目標分子引起單鏈DNA至雙鏈DNA轉化，使卟啉分子在電極表面的吸附量減少，通過光致電化學檢測卟啉分子的光致電化學信號的減小，實現對目標農殘分子或癌癥標志物的簡單、快速、免標記、均相、高靈敏檢測。
【背景技術】
[0002]光致電化學生物傳感器是最新興的一類生物傳感器，已在疾病監測與診斷、藥物分析、環境監測等領域成為強有力的生化分析及生物傳感工具。光致電化學傳感器主要是采用固體電極作為基礎電極，將生物活性分子作為分子識別探針固定在電極表面，然后通過生物分子間的特異性識別作用，使目標分子捕獲到電極表面，基礎電極將濃度信號轉換成光電壓、光電流、光阻抗等可測量的信號作為響應信號，從而實現目標分子的定量分析。此外，與現代大規模集成電路技術相結合，極易實現光致電化學生物傳感器的微型化、集成化與批量化生產，因此，光致電化學生物傳感器不僅具有靈敏度高、分析速度快、操作簡單的優點，還具備設備便攜性高、設備成本低等諸多優點，基于以上優勢，光致電化學生物傳感器在諸多現場即時分析檢測及高通量應用中大顯身手。
[0003]然而，現有的光致電化學生物傳感器大都將生物識別功能的生物分子固定在固相電極表面用來捕獲液相中目標分子的異相分析方法。異相分析法主要存在如下缺陷:一方面，生物識別分子在固相電極表面的固定過程通常是一個非常繁瑣的化學修飾過程，有時所用試劑成本很高。另一方面，由于固相電極表面的空間位阻效應，生物識別分子被固定在固相電極表面后，往往會導致生物分子的空間構象發生很大變化，并給生物分子識別位點的空間取向帶來很大的不確定性，導致固定化的生物識別分子對液相中目標分子的結合/識別能力與效率大大降低。與異相分析方法相比，完全在溶液中進行的均相生物分子識別反應不存在上述缺陷。
[0004]因此，采用均相反應的分析方法受到廣泛關注。然而，基于電極的均相分析方法目前只在電化學生物傳感器中得到一定的程度的發展。均相電化學生物傳感器主要采用氧化銦錫導電玻璃(ΙΤ0)電極作為基礎電極，且無需在ΙΤ0電極表面固定任何生物識別分子，所有的生物識別反應及其它生化反應均在溶液中進行。均相電化學生物傳感器主要通過檢測溶液中生成/激活的電化學活性物質(例如亞甲基藍或二茂鐵)標記DNA的擴散電流的強弱實現定量分析。然而，現有的均相電化學生物傳感器主要存在三大缺陷。第一，電化學活性物質需被標記在DNA鏈的末端。該標記過程亦是一個非常復雜的高難度化學修飾和提純過程，且成本極高。第二，擴散電流檢測法無法最大限度地利用溶液中生成/激活的電化學活性物質標記DNA，導致其電化學信號強度及靈敏度受限，第三，電化學生物傳感器主要通過電流/電壓激發產生電化學信號，激發源與檢測信號的能量形式相同，導致背景信號或干擾信號較高。因此，設計制備新型的免標記均相光致電化學生物傳感器，實現高靈敏度的生化分析與生物傳感勢在必行。
[0005]本發明針對這一問題，在固相電極表面原位制備一層含有苯環結構及負電官能團的復合薄膜，制備免固定生物傳感電極。該電極能夠特異性地吸附單鏈DNA，而不吸附雙鏈DNA。利用卟啉分子與電極表面吸附的單鏈DNA的親和力，可定量檢測電極表面單鏈DNA的吸附量。基于上述免固定生物傳感電極，設計一種免標記均相農殘/癌癥標志物光致電化學分析方法，該分析方法包含一個目標分子觸發的生化反應回路。該生化反應回路可根據目標分子的多少，定量地將可被電極吸附的單鏈DNA轉化為不可被電極吸附的雙鏈DNA，不僅實現目標分子的高靈敏檢測，而且提高了溶液中單鏈DNA及光致電化學活性物質的利用率。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種免固定生物傳感電極，用該電極實現農殘與癌癥標志物的免標記、均相、高靈敏光致電化學檢測。
[0007]本發明的技術方案如下:
一種免固定生物傳感電極，它是通過電還原的方式，將4-羧基苯基重氮鹽與4-聯苯基重氮鹽同時沉積在電極表面，形成復合薄膜修飾電極，即制得免固定生物傳感電極。
[0008]上述電極可以是玻碳電極、金電極或氧化銦錫導電玻璃電極(ΙΤ0)。
[0009]—種免固定生物傳感電極的制備方法，它由下列步驟組成:
步驟1.將一定量的對羧基苯胺與4-氨基聯苯混合后溶于含有0.2 - 0.7M HC1的無氧水溶液中，對羧基苯胺與4-氨基聯苯的摩爾比為5:1-1:5 ;
步驟2.在不斷攪拌的前提下，將濃度為1 - 8mM的亞硝酸鈉無氧水溶液以0.2 -0.5mL/min的速度滴入到步驟1所得的溶液中，反應20 - 50min，即制得重氮鹽混合液，攪拌速度為 1000 - 3000 r/min ；
步驟3.若所用電極為金電極或玻碳電極，需將電極依次用粒徑為1.0、0.3和0.05微米的A1203拋光粉拋光，金電極還需再浸入一定濃度的硫酸溶液中，進行循環伏安掃描，直至循環伏安曲線穩定，若所用電極為ΙΤ0電極，只需將ΙΤ0電極在2.0 - 9.0mol/L的NaOH溶液中浸泡4 - 9小時，以上每步處理后均需用超純水充分淋洗并氮氣吹干；
步驟4.如圖1所示，將步驟3所得電極浸入到步驟2所得重氮鹽混合液中，以此電極為工作電極，飽和甘汞電極或Ag/AgCl電極為參比電極、鉑絲為對電極，在0.5 V至-0.3V電壓范圍內進行兩次連續的循環伏安掃描，掃描速度為100 - 200 mV/s ;
步驟5.將步驟4所得電極分別在乙腈和超純水中超聲清洗2 - 8min，氮氣吹干，即制得免固定生物傳感電極。
[0010]上述對羧基苯胺可以替換為對磺酸基苯胺。
[0011]上述4-氨基聯苯可以替換為苯胺。
[0012]—種基于上述免固定生物傳感電極的免標記均相光致電化學生物傳感器，它以含有1 - 5 μ Μ無任何標記的DNA發卡(DNA-1)、1 - 5 μ Μ無任何標記的DNA單鏈(DNA-2)、1 - 8U的DNA聚合酶、100 - 500 μ Μ脫氧核糖核苷三磷酸混合物(dNTPs)的混合溶液為檢測液，以含有2 - 5mM卟啉的Tris - HC1緩沖液為信號液。
[0013]如圖2所示，上述DNA-1具有莖-環結構，從5’端開始的前50個堿基包含目標分子的特異性核酸適配體序列，其余為隨機序列。
[0014]如圖2所示，上述DNA-2包含兩個序列段，從3’端開始的序列段與DNA-1的3’端莖序列完全互補配對，另一個序列段為隨機序列。
[0015]上述的卟啉為5，10, 15，20-四(4_氨基苯基)卟啉、5，10, 15，20-四(N-甲基-4-吡啶鑰)卟吩對甲苯磺酸鹽或α，β，γ，δ -四(4-Ν-三甲基氨基苯基)卟吩。
[0016]上述檢測液的緩沖體系為含50 mM NaClUO mM MgCl2、l mM 二硫蘇糖醇的10 mMTris - HC1 緩沖體系，pH= 7.9。
[0017]上述免標記均相生物傳感器，它由下列操作步驟組成:
步驟1.將5 - 10 μ L含有不同濃度目標分子的樣品溶液與40 - 45 μ L檢測液混合，溫育反應20 - 120 min分鐘，溫度為20 - 40攝氏度，
步驟2.將步驟1所得溶液轉移至免固定生物傳感電極表面，溫育反應20 - 50 min，溫度為20 - 40攝氏度，
步驟3.將步驟2所得的電極用超純水充分淋洗后，在卟啉信號液中浸泡20 - 50min，取出后用超純水充分淋洗，
步驟4.光致電化學檢測，將步驟3所得電極浸入含有0.1 - 0.6M的抗壞血酸的磷酸鹽緩沖電解質中，進行光致電化學檢測，工作偏壓為-1 V至IV，光源波長為500 - 200 nm，光源強度為100 - 200W/m2。
[0018]上述免固定生物傳感電極區分單鏈DNA與雙鏈DNA的原理:
單鏈DNA堿基上的多元雜環是完全暴露的，可與復合薄膜表面的苯環之間產生較強的π - π共軛作用力，該作用力比DNA磷酸脂骨架與復合薄膜表面羧基之間的負-負靜電排斥作用力更強，使得單鏈DNA可被牢固地吸附到該復合薄膜表面；當單鏈DNA與其互補序列雜交形成雙鏈DNA后，堿基上的多元雜環被隱藏在雙鏈DNA的雙螺旋結構中，導致其無法與復合薄膜表面的苯環產生31-31共軛作用力，在DNA磷酸脂骨架與復合薄膜表面羧基之間的負-負靜電排斥作用力下，雙鏈DNA無法吸附在該復合薄膜，因此，該復合薄膜修飾的免固定生物傳感電極可特異性地區分單鏈DNA與互補配對的雙鏈DNA。
[0019]本免標記均相光致電化學生物傳感器測定農殘/癌癥標志物的原理如圖3所示: 不存在目標分子時，DNA-1和DNA-2之間不會發生任何雜交反應，且均可吸附到免固定生物傳感電極表面；此時卟啉可借助電極表面的DNA-1與DNA-2吸附到電極表面，產生較強的光致電化學信號響應；當目標分子存在時，目標分子與DNA-1中核酸適配體序列發生特異性結合，使DNA-1發生構象轉化，其發卡結構被打開，并與DNA-2發生互補配對，雜交生成較短的DNA雙鏈結構，DNA聚合酶可同時識別該DNA雙鏈結構中DNA-1和DNA-2的3’端，并分別以DNA-2和DNA-1為模板，將DNA-1和DNA-2的3’端聚合延長，該聚合延長過程同時破壞了目標分子與DNA-1中核酸適配體序列的結合，釋放出的目標分子可與下一個DNA-1結合，從而繼續引發新一輪DNA聚合延長反應，最終將大量的DNA-1和DNA-2轉變為無法吸附到免固定生物傳感電極表面表面的長雙鏈DNA (堿基對數大于30對)，導致DNA-1與DNA-2在電極表面吸附量的減少及P卜啉光致電化學響應的降低。
[0020]本發明與現有技術相比，具有以下特點:
本發明提供了一種可特異性吸附單鏈DNA而不吸附雙鏈DNA的免固定生物傳感電極，結合一種配套的免標記均相農殘/癌癥標志物分析方法，構建高靈敏度、高選擇性的農殘/癌癥標志物光致電化學生物傳感器，相對現有的農殘/癌癥標志物檢測方法，具有以下特占.(1)本發明所述的免固定生物傳感電極，在不固定任何生物識別分子的前提下，可直接檢測生物分子的吸附電流，與傳統均相電化學中的擴散電流檢測相比，信號強度要高三個數量級。
[0021](2)本發明所述的免固定生物傳感電極是通過電還原苯基重氮鹽的方式制備的，通過該方法獲得的電極表面有機復合薄膜穩定性高，重復性好，可重復使用50次以上，并可在室溫下穩定存儲4個月以上。
[0022](3)本發明所述的基于免固定生物傳感電極的免標記均相光致電化學生物傳感器采用核酸適配體作為分子識別探針，與傳統農殘/癌癥標