二水合檸檬酸三鈉拮抗重金屬污染物聯合毒性的篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及重金屬污染物驅排技術領域，尤其涉及多種重金屬污染物聯合毒性的驅排，特別指的是二水合檸檬酸三鈉拮抗重金屬污染物聯合毒性的篩選方法。
【背景技術】
[0002]重金屬一般是指比重大于4.0的金屬元素，重金屬或其化合物是環境中一類很難降解的污染物，廣泛存在大氣、水體、土壤等環境介質中并引起嚴重的環境污染。重金屬污染指由重金屬或其化合物造成的環境污染。近年來，我國關于重金屬污染事件屢見不鮮，從兒童血鉛群體超標，到重金屬污染“鎘大米”等等，重金屬污染已嚴重影響到人民的生活環境和身體健康。
[0003]重金屬元素是地殼巖石中的天然組分，在采礦、冶煉、工業生產以及煤、石油燃料燃燒過程中進入大氣、水、土壤，造成環境污染。環境中的重金屬具有較強的生物富集性，可以通過各種途徑進入人體并在體內長期積累，當濃度超過一定限度時會對人體的多種器官(肝臟、腎臟等)及系統(泌尿系統、神經系統等)造成嚴重的損壞作用，從而對人體造成很大的危害。其中，水是最重要的污染途徑。重金屬可以通過食物鏈經水生藻類、植物、動物器官組織逐級濃集放大，最終進入并蓄積在人體內。水以及水中生物(包括魚蝦貝類)中的重金屬污染與富積，是重金屬污染危害人類健康的重要途徑。如日本發生的甲基汞污染水體引發的水俁病。
[0004]關于單一重金屬的毒性，已有很多研究報道，如鉛的主要毒性是引起貧血、神經機能失調。鎘可以置換骨中鈣，使骨骼軟化，并能干擾人體內的酶系統，導致高血壓癥。汞在腦組織中積累達到一定量時，能對腦組織造成損害。進入水體的無機汞離子還可以轉變為毒性更大的有機汞，由食物鏈進入人體，引起全身中毒。另外，鉻、鎘、鎳等重金屬均有致癌作用。值得注意的是，當前，在重金屬毒性研究中，多集中于單一或兩種重金屬之間的聯合毒性，三種以上重金屬的聯合毒性研究很少見，這是因為多種重金屬之間存在著錯綜復雜的相互作用，聯合染毒可能影響彼此的吸收、轉運、分布、排泄和生物轉化等過程，給研究帶來很大的困難。然而，在實際接觸過程中，多種重金屬污染物往往正是同時存在并同時進入人體內的。因此，多種重金屬污染物同時接觸后的聯合毒性效應以及防治措施，是一個無法繞過而且亟待研究解決的問題。
[0005]重金屬污染物種類繁多，盡管各自的生物毒性機制差異很大，但也存在一些共同點。首先，大多數重金屬離子可直接或通過代謝產物間接與機體生物大分子、細胞器以及細胞內鈣穩態和轉運系統等發生反應。另外，研究表明，幾乎所有的重金屬離子，在體內都可以引起活性氧基團的產生，進而導致細胞組織氧化應激損傷。金屬中毒的傳統臨床治療方法多采用絡合劑，絡合劑與重金屬離子結合，可形成穩定的配合物，從而起到解毒作用。不同重金屬元素在水產品中的蓄積量不同，水產中人體所必需的鋅、銅、錳及鎂等的蓄積量遠高于萊、鎘、鉛和絡，高濃度的鋅、銅、錳及鎂等產生的毒性遠高于低蓄積量的萊、鎘、鉛和鉻等。一些經典的拮抗汞、鎘、鉛和鉻毒性的拮抗劑，在拮抗這些重金屬聯合毒性時顯得捉襟見肘。所以拮抗這些重金屬聯合毒性的新型的拮抗劑亟待尋找。
[0006]檸檬酸鈉又稱枸櫞酸鈉，是目前最終要的檸檬酸鹽，具有水溶性好，對水中的鋅、鎂和銅等金屬離子具有優良的螯合能力。其主要由淀粉類物質經發酵生成檸檬酸，再跟堿類物質中和而產生，具有安全無毒性能。聯合國糧農與世界衛生組織對其每日攝入量不作任何限制，可認為該品屬于無毒品。
【發明內容】
[0007]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的現狀，提供篩檢速度快，費用低的二水合檸檬酸三鈉拮抗重金屬污染物聯合毒性的篩選方法。
[0008]本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為:
二水合檸檬酸三鈉拮抗重金屬污染物聯合毒性的篩選方法，包括以下步驟:
步驟一、配置多種重金屬污染物的混合溶液；
步驟二、通過MTT實驗確定重金屬混合溶液的LC50 ;
步驟三、將二水合檸檬酸三鈉作為拮抗劑，將待篩選的不同濃度的二水合檸檬酸三鈉水溶液和半數細胞致死濃度的重金屬混合溶液依次混合，并加入到培養基中作細胞系培養;
步驟四、MTT細胞生存活力試驗:染毒24小時，再加MTT溫育3至4小時；進行細胞生存活力測定，得出待篩選的不同濃度的化學拮抗劑的拮抗效率。
[0009]為優化上述技術方案，采取的具體措施還包括:
上述的多種重金屬污染物的混合溶液包含有重金屬元素鉛、鎘、汞、銅、鋅、錳、鉻以及鎳。
[0010]上述的細胞系為HL7702細胞系。
[0011]上述的溫育的溫度為37°C。
[0012]上述的二水合檸檬酸三鈉水溶液的給藥濃度為0.175g/L至1.225g/L。
[0013]上述的二水合檸檬酸三鈉水溶液的給藥濃度為0.175g/L。
[0014]上述的二水合檸檬酸三鈉水溶液的給藥濃度為0.525g/L。
[0015]上述的二水合檸檬酸三鈉水溶液的給藥濃度為0.875g/L。
[0016]上述的二水合檸檬酸三鈉水溶液的給藥濃度為1.225g/L。
[0017]本發明拮抗劑的篩選方法，采用體外細胞MTT法，篩檢速度快，費用低；其采用二水合檸檬酸三鈉作用多種重金屬污染物聯合毒性的拮抗劑使用，開發了二水合檸檬酸三鈉新的功用；本篩選方法能夠同時對不同濃度的拮抗劑進行篩選，篩選效率高。
【附圖說明】
[0018]圖1是八種重金屬混合物加入二水合檸檬酸三鈉后的HL7702細胞生存率變化圖；
圖2是重金屬溶液儲備液配置圖表；
圖3是實驗中二水合檸檬酸三鈉藥劑量分組圖表；
圖4是實驗中各組實驗給藥圖表。
【具體實施方式】
[0019]以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0020]二水合檸檬酸三鈉拮抗重金屬污染物聯合毒性的篩選方法，包括以下步驟: 步驟一、配置多種重金屬污染物的混合溶液；
步驟二、通過MTT實驗確定重金屬混合溶液的LC50 ;
步驟三、將二水合檸檬酸三鈉作為拮抗劑，將待篩選的不同濃度的二水合檸檬酸三鈉水溶液和半數細胞致死濃度的重金屬混合溶液依次混合，并加入到培養基中作細胞系培養;
步驟四、MTT細胞生存活力試驗:染毒24小時，再加MTT溫育3至4小時；進行細胞生存活力測定，得出待篩選的不同濃度的化學拮抗劑的拮抗效率。
[0021 ] 所述的多種重金屬污染物的混合溶液包含有重金屬元素鉛、鎘、汞、銅、鋅、錳、鉻以及鎳。
[0022]所述的細胞系為HL7702細胞系。
[0023]所述的溫育的溫度為37 °C。
[0024]所述的二水合檸檬酸三鈉水溶液的給藥濃度為0.175g/L至1.225g/L。
[0025]下面通過實驗證明二水合檸檬酸三鈉(C6H5Na307*2H20)在拮抗多種重金屬污染物混合后的聯合毒性中確有作用。實驗中，二水合檸檬酸三鈉水溶液的給藥濃度分別為
0.175g/L、0.525g/L、0.875g/L 以及 1.225g/L。
[0026]—、配置8種重金屬原液進行實驗。
[0027]1、重金屬溶液儲備液配置
按照圖2所示的重金屬溶液儲備液配置圖表配置重金屬溶液。
[0028]其中，(CH3C00)2Pb*3H20、CdCl2.2.5H20、NiCl2.6H20、MnCl2.4H20、ZnS04.7H20、CuS04*5H20、K2Cr207、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、二甲亞砜均為分析純，購買自國藥集團化學試劑有限公司。CH3ClHg購買自德國Dr.Ehrenstor