一種快速發現天然產物中低含量活性成分的新方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及天然產物中化合物提取分離領域，具體涉及一種快速發現復雜天然產 物中低含量活性成分的方法。 技術背景
[0002] 天然藥物主要指天然來源的植物（中草藥）、動物、微生物、海洋生物及其他生物 的具有明確治療作用的單一成分或多組分藥物。
[0003] 天然藥物是現代創新藥物發現的重要來源。許多天然來源的化合物已被發現具 有多樣且獨特的生理活性，在此基礎上一大批具有特殊治療作用的藥物被開發出來。天然 活性物質往往具有結構新穎、活性高、不良反應少的特點，是制藥工業中新藥研發的重要來 源，也是我國研制具有自主知識產權的創新藥物的主要源泉（參見：蕭偉，陳鳳龍；國內外 天然藥物研究的發展現狀和趨勢，中草藥，2009,11 :1681-1687)。
[0004] 大多數天然產物成分復雜，含量差異懸殊。生藥中除了含量較高的成分以外，還含 有數量眾多、含量較低的成分。這些微量成分不僅在天然藥物療效的發揮中扮演重要角色， 同時其結構和生物功能的多樣性也為新藥研發提供了有價值的信息。許多從天然產物中分 離得到的微量成分具有新穎的化學結構和顯著的生物學活性，可作為重要的先導化合物， 有些還被直接開發成臨床藥物。例如，抗腫瘤藥物紫杉醇和長春新堿、抗瘧藥物青蒿素等都 是從植物中發現的微量成分。此外，隨著科研的不斷深入，天然產物中高含量的活性成分已 越來越多地得到發現和研究，從新的天然資源如海洋生物和研究較少的微量天然產物中尋 找新的活性成分是天然藥物研發的重要方向之一。
[0005] 然而從復雜的天然產物中發現新的微量活性成分卻相當耗費時間、人力、物力卻 又低效。傳統的對大量復雜天然產物進行提取、分離、反復柱色譜進行純化的方法常常導 致生藥中的微量成分在多次柱色譜處理過程中損失，較難獲得足夠量的高純度單體進行篩 選。為發現更多的微量成分，通常采用加大生藥投料量的方式來累積微量成分，但同時也會 造成分離工作量的成倍增加和高含量成分的大量干擾，微量活性成分的發現效率依舊難以 提高。另有報道將天然產物提取物采用制備型高效液相分離，按時間分段收集餾分，并將各 餾分經脫溶劑處理后用于活性篩選。因天然藥物成分眾多且結構復雜多樣，按時間自動化 收集的餾分往往是包含2個以上成分的混合物，經初次活性測定后，還需要對顯示有活性 的餾分進一步分離純化，制備出單體化合物，即需重復進行樣品富集、分離純化、餾分收集、 溶劑去除、樣品干燥、活性測試和結構鑒定等步驟來確定活性餾分中的活性成分。更重要的 是，餾分中的微量成分很可能因達不到活性起效的濃度而被漏篩。因此，提高從天然產物中 發現微量活性化合物的效率，縮短發現時間，降低發現成本，是天然藥物活性成分研究和 開發亟需解決的問題之一。
[0006] CN103487531A公開了一種適用于復雜天然產物高通量篩選的化合物庫高效制備 方法，該方法能夠快速、精確、自動化地制備指紋圖譜中各指紋峰對應的餾分，所制備樣品 純度高，餾分不易含有共洗脫成分。但該方法由于未將復雜天然產物中的高、低含量成分區 別對待，在基于全成分色譜指紋圖譜的餾分制備過程中，當高含量成分的制備量達到活性 篩選的起效濃度時，而低含量成分由于制備量較低，往往尚未達到起效濃度而難以被發現。 因此該方法不能有效地解決低含量活性成分的發現難題。
[0007] 本發明針對天然藥物中的微量活性成分，在將全成分劃分為高低含量成分的基礎 上，結合色譜峰敲除技術和高純度餾分制備手段，快速、自動化、選擇性地富集低含量餾分， 使低含量成分達到能夠進行篩選的有效濃度，從而顯著提高復雜天然產物中微量活性成分 發現的靈敏度、精確度及篩選效率，有利于活性成分的快速發現。
【發明內容】
[0008] 針對天然藥物中成分含量差異懸殊的情況，本發明建立了一種適合天然藥物中低 含量活性成分快速發現的方法。
[0009] 本發明首先建立天然藥物提取物的常規液相色譜分析方法，建立全成分色譜指紋 圖譜；然后，將提取物中各成分根據其相對含量劃分為高含量成分和低含量成分，基于指紋 圖譜采用高分辨色譜峰餾分制備方法建立高含量成分餾分庫，并對敲除高含量成分后的流 出液（包含低含量成分）進行富集、濃縮，經二次高分辨色譜峰餾分制備獲得低含量餾分 庫；采用串聯質譜檢測器同步獲取高、低含量餾分庫的質譜信息進行化合物鑒定；進而開 展對高、低含量餾分的活性測試和量效關系考察，實現對天然藥物中微量成分的活性評價。 [0010] 該方法快速、精確、自動化程度高、操作簡便、成本較低、適用性強，適用于天然產 物中微量活性成分的發現。
[0011] 本發明包括以下內容：
[0012] -種快速發現天然產物中低含量活性成分的方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0013] (1)以一種天然來源的植物、動物、微生物、海洋生物或中藥復方等為對象，制備相 應的提取物；
[0014] (2)采用常規液相色譜系統與自動組分收集系統聯用，建立上述分析對象的全成 分色譜指紋圖譜條件；
[0015] (3)高低含量成分的劃分：采用面積歸一化法，將各活性化合物在樣品制備色譜 圖中顯示的峰面積，分別與各活性化合物在樣品制備色譜圖中顯示的峰面積的總和相比， 得到各活性成分的相對含量。并將各活性成分的相對含量按照從低到高的順序排序，選擇 合適的標準將全成分劃分為高含量成分和低含量成分；
[0016] (4)高含量餾分庫的建立：
[0017] 運行步驟（2)中的色譜指紋圖譜條件，通過軟件設置各指紋峰的起始時間和結束 時間以及收集位置，使組分收集系統的程序根據上述設置，自動、精確地收集各指紋峰；單 次進樣直接收集高含量成分獲得高含量餾分庫；
[0018] 低含量餾分庫的建立：
[0019] 敲除高含量成分之后對低含量成分進行富集，樣品經回收溶劑后再次進樣，自動、 精確收集指紋圖譜中的每一個色譜峰（餾分）；
[0020] (5)采用串聯質譜檢測器同步獲取高、低含量餾分庫的質譜信息進行化合物鑒 定；
[0021] (6)對每個餾分進行脫溶劑處理，以備后續篩選。
[0022] 本發明包括以下內容：
[0023] (1)以一種天然來源的植物、動物、微生物、海洋生物或中藥復方等為對象，制備相 應的提取物。所述的提取物是采用高、中、低極性或不同酸堿性溶劑分別提取天然來源的研 究對象所得到的或經初步分離得到的混合物。
[0024] (2)采用高效液相色譜進行樣品的色譜表征和優化，建立該提取物的指紋圖譜。
[0025] 建立全成分指紋圖譜的液相色譜的色譜條件可以是：分離采用的色譜柱內徑 < 20mm、粒徑< 5 μπι ;流速為0. 5-10mL/min，分析時間< 3h ;優選的，色譜條件可以是：分 離采用的色譜柱內徑彡l〇mm、粒徑彡5 μπι ;流速為1~5mL/min，分析時間彡2h ;更優選的， 色譜條件可以是：分離采用的色譜柱內徑彡5mm、粒徑彡5 μπι;流速為1~2mL/min，分析時 間彡2h。
[0026] (3)高、低含量成分的劃分：具體實施方法可以根據高效液相色譜或質譜響應采 用面積歸一化法、標準曲線法、內標法以及標準加入法進行定量分析。按照測量參數可以分 為峰面積法或峰高法分析化合物的含量。將化合物的含量按照從低到高排序，將全成分劃 分為高含量成分和低含量成分；
[0027] (4)高含量成分餾分庫的制備：運行⑵中的指紋圖譜色譜分析條件，通過軟件設 置高含量目標峰的起始時間和結束時間以及收集位置，使組分收集系統的程序根據上述設 置，自動、精確地收集高含量目標峰。可根據餾分的體積適當調整收集容器的大小。單次進 樣收集高含量目標成分色譜峰（餾分），對每個餾分進行脫溶劑處理，獲得高含量成分餾分 庫。
[0028] (5)低含量成分餾分庫的制備：重復數次（4)，將高含量目標峰以外的流出液，即 敲除高含量目標峰后的低含量成分的混合液，收集于同一容器。根據低含量餾分實際濃度 的需要，可選擇重復2~5次或更多次，收集的混合液經脫溶劑處理后，再次進樣，運行指 紋圖譜色譜分析條件，對照全成分色譜圖和富集后的低含量成分色譜圖中每個色譜峰的出 峰順序，對所有低含量成分色譜峰進行編號，按照上述餾分收集程序的設置方法，重新設置 低含量成分的餾分收集程序，自動、精確收集低含量成分指紋圖譜中的每一個色譜峰（餾 分），對每個餾分進行脫溶劑處理，獲得經過富集的低含量成分餾分庫。
[0029] (6)對每個餾分進行脫溶劑處理：可采用氮吹、加熱或真空離心干燥等方式進行 快速脫溶劑處理，以備后續篩選。
[0030] (7)液相色譜-組分收集系統同步聯接質譜檢測器，液相流出液在線分流后進入 質譜檢測器，同時獲得高、低含量色譜峰各自對應的質譜信息，對收集得到的各餾分進行純 度檢測、結構推測和成分鑒定。
[0031] (8)制備的高、低含量餾分庫樣品可用于多種模型的高通量篩選，因各餾分化合物 的量不一致，可設計高、中、低三個給藥濃度進行給藥，即將每個餾分樣品不同倍數稀釋成 高、中、低三個濃度分別測試，根據活性測定值并結合與濃度的關系來評判樣品有無活性。
[0032] 本發明包括以下內容：
[0033] (1)以一種天然來源的植物、動物、微生物、海洋生物或中藥復方等為對象，制備相 應的提取物。所述的提取物是采用高、中、低極性或不同酸堿性溶劑分別提取天然來源的研 究對象所得到的或經初步分離得到的混合物。
[0034] (2)采用高效液相色譜進行樣品的色譜表征和優化，建立該提取物的指紋圖譜。
[0035] 建立全成分指紋圖譜的液相色譜的色譜條件可以是：分離采用的色譜柱內徑 < 20mm、粒徑< 5 μπι