；
[0038] 5)電泳，觀察。
[0039] 按照上述方法分別用丹酰肼的鈉鹽、鉀鹽、銨鹽進行糖蛋白預染，結果表明用這些 衍生物均能夠得到類似于丹酰肼的檢測結果。
[0040] 圖2是說明丹酰肼糖蛋白特異性熒光預染檢測法與其它染色法效果對比。
[0041] 按照實施例1的方法，采用不同染色方法進行染色，
[0042] 圖2中（A-D)在一向SDS-PAGE膠上，不同方法對Sigma公司的八種不同標準蛋白 質樣品選擇性及靈敏度比較。（A)丹酰肼糖蛋白熒光預染檢測法，（B)丹酰肼糖蛋白熒光預 染檢測法檢測后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢測，（C)Pro-Q Emerald糖蛋白熒光染色 法，（D)Pro-Q Emerald糖蛋白熒光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢測。帶1， 1000 ng ;帶 2,500ng ;帶 3,250ng ;帶 4,125ng ;帶 5,64ng ;帶 6,32ng ;帶 7,16ng ;帶 8,8ng ; 帶9,4ng;帶10, 2ng。Pro-Q Emerald糖蛋白熒光染色法、SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法均 按照文獻記載操作；圖中名稱用斜體字表示為糖基化蛋白質。
[0043] (E-H)為在一向SDS-PAGE膠上，不同方法對提取的人血清樣品選擇性及靈敏度比 較。（E)丹酰肼糖蛋白熒光預染檢測法，（F)丹酰肼糖蛋白熒光預染檢測法檢測后用SYPRO Ruby全蛋白突光染色法檢測，（G)Pro-Q Emerald糖蛋白突光染色法，（H)Pro-Q Emerald糖 蛋白熒光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢測。帶l，5000ng;帶2,2500ng;帶 3,1250ng ;帶 4,625ng ;帶 5, 320ng ;帶 6,160ng ;帶 7,80ng ;帶 8,40ng ;帶 9, 20ng ;帶 10, 10ng。Pro-Q Emerald糖蛋白突光染色法、SYPRO Ruby全蛋白突光染色法均按照文獻記載 操作。
[0044] 丹酰肼糖蛋白熒光預染檢測法檢測靈敏度接近Pro-Q Emerald488糖蛋白熒光染 色法。在選擇性方面，僅糖基化蛋白（名稱用斜體字表示）能被丹酰肼預染檢測法及Pro-Q Emerald488檢測，SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法則能檢測凝膠上所有類型蛋白。
[0045] 圖3是說明丹酰肼糖蛋白熒光預染檢測法結合二向電泳技術對糖基化蛋白進行 特異性檢測。
[0046] 將人血清總蛋白經二向凝膠電泳分離后，分別采用實驗例1的（A)丹酰肼糖蛋白 熒光預染檢測法，（B)丹酰肼糖蛋白熒光預染檢測法檢測后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色 法檢測，（C)Pro-Q Emerald糖蛋白突光染色法，（D)Pro-Q Emerald糖蛋白突光染色法后用 SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢測進行染色，結果如圖3所示。顯示丹酰肼糖蛋白熒光預 染檢測法能在二向凝膠電泳技術基礎上對糖基化蛋白進行特異性檢測。
[0047] 圖4是說明在一向SDS-PAGE膠上，不同方法對去糖基化樣品選擇性，樣品為用 PNGase F去除N-鏈糖后的人血清總蛋白。帶TP，人血清總蛋白；帶DP，去N-鏈糖后人血清 總蛋白；Pre-S組為丹酰肼糖蛋白熒光預染檢測法，Pre-S+SR組為丹酰肼糖蛋白熒光預染 檢測法檢測后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢測，Pro-Q組為Pro-Q Emerald糖蛋白熒 光染色法，Pro-Q+SR組為Pro-Q Emerald糖蛋白熒光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白熒光 染色法檢測。結果如圖4所示。去除N-鏈糖后的標準蛋白人血清總蛋白可被SYPRO Ruby 全蛋白突光染色法檢測，但幾乎不能被丹酰肼糖蛋白突光染色法及Pro-Q Emerald糖蛋白 熒光染色法識別。進一步說明丹酰肼糖蛋白熒光染色法對糖蛋白檢測具有高度特異性。
[0048] 圖5是在一向SDS-PAGE膠上，不同方法對富集后糖基化蛋白選擇性比較，樣品為 使用糖基化富集試劑盒從人血清總蛋白中富集出的糖蛋白。帶TP，未富集的人血清總蛋 白；帶Con A Enriched Glycoproteins,使用糖基化富集試劑盒從人血清總蛋白中富集出 的糖蛋白；SR組為SYPRO Ruby全蛋白熒光檢測法，Pre-S組為丹酰肼糖蛋白熒光預染檢測 法，Pre-S+SR組為丹酰肼糖蛋白熒光預染檢測法檢測后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法 檢測，Pro-Q組為Pro-Q Emerald糖蛋白焚光染色法，Pro-Q+SR組為Pro-Q Emerald糖蛋白 熒光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白熒光染色法檢測。
[0049] 圖2-5中的參考染色方法及其相關文獻
[0050] Pro-Q Emerald488糖蛋白染色法操作方法參見文獻：Courtenay Hart.，Birte Schulenberg.，Thomas H.Steinberg. , Wai-Yee Leung. , Wayne F.Patton, R. (2003) Detection of glycoproteins in polyacrylamide gels and on electroblots using Pro-Q Emerald488dye， a fluorescent periodate Schiff-base stain. Electrophoresis24, 588-598。
[0051] SYPRO Ruby焚光染色法操作方法參見文獻：Malone，J.，Radabaugh，M.， Leimgruber，R.，Gerstenecker，G. (2001) Practical aspects of fluorescent staining for proteomic application. Electrophoresis22,919-932.
【主權項】
1. 丹酰肼及其衍生物在糖蛋白特異性熒光預染檢測法中的應用。2. 如權利要求1所述的應用，其特征在于所述的丹酰肼及其衍生物為丹酰肼的鈉鹽、 鉀鹽或銨鹽。3. -種凝膠上糖蛋白特異性熒光預染檢測法，其包括步驟： 1) 在1-20μL含0· 5-10μg蛋白樣品（不足1-20μL用重蒸水補足）中加入 0. 005-0. 05Μ高碘酸水溶液1-20μL，置于避光處進行氧化反應5-30min; 2) 在反應液中加入0. 1-0. 3M抗壞血酸1-10μL，搖勻反應0. 5-5min; 3) 在反應液中加入丹酰肼或其衍生物按體積比1-5%二甲基亞砜溶液1-5μL，37°C環 境下反應10_50min; 4) 在反應液中加入10-50μL3X蛋白質上樣緩沖液，搖勻； 5) 電泳，觀察。4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟1)中蛋白樣品體積為10yL;所加高碘 酸水溶液體積為10μL，摩爾濃度為0. 03M，避光反應。5. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2)中所加抗壞血酸溶液體積為5μL， 摩爾濃度為〇. 24Μ。6. 如權利要求3~5任一項所述的方法，其特征在于，步驟3)所加丹酰肼或其衍生物 溶液為按體積比2%的二甲基亞砜溶液2. 5μL，37°C環境下反應30min。7. 如權利要求3~5任一項所述的方法，其特征在于，步驟4)向反應液中加入30μL3X 蛋白質上樣緩沖液。8. 如權利要求3~5任一項所述的方法，其特征在于，步驟1)氧化時間為lOmin;步驟 2)反應時間為lmin;步驟3)反應時間為30min。9. 如權利要求3~5任一項所述的方法，其特征在于，步驟5)可在激光掃描儀下觀察 染色后的糖蛋白。
【專利摘要】本發明涉及糖蛋白特異性熒光預染檢測法，具體地說是丹酰肼及其衍生物在糖蛋白特異性熒光預染檢測法中的應用。本發明還提供了應用丹酰肼進行糖蛋白特異性熒光預染檢測的方法，包括步驟：向蛋白質樣品中加入高碘酸溶液進行氧化；加入抗壞血酸溶液中和過量高碘酸溶液；加入染料反應；加入上樣緩沖液；電泳；觀察。本預染發明具有靈敏度高、選擇性好、操作簡單迅速、重現性好、線性關系好、質譜兼容性好、使用安全、成本低廉等優點。此外相對于凝膠電泳后糖蛋白染色方法，預染檢測法在電泳結束后即可觀察，節省了凝膠電泳后染色步驟，可較好地適用于高通量蛋白質組學的研究。
【IPC分類】G01N1/30, G01N33/68
【公開號】CN105259005
【申請號】CN201410350554
【發明人】金利泰, 朱忠欣, 洪國贏, 玄元虎, 于擎, 汪佳男, 叢維濤
【申請人】溫州醫科大學
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2014年7月16日