通過轉錄因子tsc22d4的抑制劑治療胰島素抵抗的制作方法
【專利說明】通過轉錄因子TSG22D4的抑制劑治療胰島素抵抗
[0001] 本發明涉及TSC22D4的活性或表達的調節劑，特別是其抑制劑，以及它們在哺乳 動物中用于預防、治療和/或調節胰島素抵抗、代謝綜合征和/或糖尿病，和/或用于提高 胰島素敏感性的用途。本發明還涉及鑒定這些調節劑的篩選方法、所鑒定的調節劑在這些 疾病的診斷中的用途，以及包含用于實施本發明的方法的材料的試劑盒。
[0002] 發明背景
[0003] 在人類中，脂質的過度貯積與其移除的減少的組合導致超重和相關的合并 癥（co-morbidities)，包括胰島素抵抗、心血管并發癥以及血脂異常（LanginD.In andout:adiposetissuelipidturnoverinobesityandhyslipidemia.Cell Metab. 2011Nov2 ;14(5) :569-70)，其現在世界范圍內影響了超過15億人（Finucane MM,etal.National,regional,andglobaltrendsinbody-massindexsince 1980:systematicanalysisofhealthexaminationsurveysandepidemiological studieswith960country-yearsand91millionparticipants.Lancet. 2011Feb12; 377 (9765) : 557-67)。確實，胰島素抵抗代表了所謂的代謝綜合征的核心部分，其最終導致 代謝功能紊亂的發生，如葡萄糖耐受不良、胰島β細胞衰竭以及最終的2型糖尿病。
[0004] 胰島素分泌（β細胞）受損、肝臟葡萄糖產生（肝臟）增加以及周圍（肌肉）葡萄 糖利用減少，構成了導致2型糖尿病的發生和發展的常規主要缺陷。現在已知，最終導致胰 島素分泌減少的β細胞衰竭在2型糖尿病的自然史中比最初據信的要更早發生。此外，對 2型糖尿病的病理生理學的更好理解，揭示了現在被稱為發病八重奏（ominousoctet)的 經典三聯癥（triad)之外的其它病原學機制。除β細胞、肝臟和肌肉之外，其它致病機制 包括脂肪細胞胰島素抵抗（脂解增加）、腸降血糖素分泌/敏感性降低（胃腸的）、胰高血 糖素分泌增加（α細胞）、葡萄糖重吸收增強（腎臟）以及神經遞質功能障礙導致的中樞神 經系統胰島素抵抗（腦部）。當前，2型糖尿病的管理著重于通過降低血糖（禁食和餐后） 以及血紅蛋白A(lc)來進行葡萄糖控制。然而，治療的目的應當是延緩疾病的進程，以及最 終的治療失敗。治療應當靶向疾病已知的致病性障礙（disturbances)(即降低β細胞功 能的退化和增強胰島素敏感性）。近年來，治療策略著重于發展影響多種導致2型糖尿病的 缺陷的新型治療方式，以及發展通過鈍化疾病進程來提供持久的葡萄糖控制的新型治療方 式。2型糖尿病的優化管理應當包括利用具有不同作用機制的多種藥物的組合在早期開始 治療（DeFronzoRA.(Currentissuesinthetreatmentoftype2diabetes.Overview ofneweragents:wheretreatmentisgoing.AmJMed. 2010Mar；123(3Suppl):S38-48)〇
[0005] 特別是主要的代謝器官（包括肝臟、骨骼肌和脂肪組織）針對胰島素作用的敏感 性，極大地促進了疾病進程以及藥物介入的最終需求，以預防糖尿病晚期并發癥。因此，有 效和安全的胰島素敏化仍是抗糖尿病療法的有吸引力的靶標和目的。
[0006] 轉錄輔助因子復合物已經被確定為不同組織包括肝臟和白色脂肪組織 (WAT)中的代謝程序協調中的重要檢驗點（參見綜述：Sommerfe1dA,Krones-Herzig A,HerzigS.Transcriptionalco-factorsandhepaticenergymetabolism.MolCell Endocrinol. 2011Jan30 ;332 (1-2):21-31)。
[0007]KesterHA,etal. (in:Transforminggrowthfactor-beta-stimulated clone_22isamemberofafamilyofleucinezipperproteinsthatcanhomo-and heterodimerizeandhastranscriptionalrepressoractivity.JBiolChem. 1999Sep 24;274(39):27439-47)描述了，TGF-β-刺激的克隆-22(TSC-22)編碼在進化中高度保守 的包含亮氨酸拉鏈的蛋白。
[0008] 此外，Jonesetal.(inJones,A.,etal. ,Transforminggrowthfactor-betal StimulatedClone_22D4isamolecularoutputofhepaticwastingmetabolism.ΕΜΒ0 MolMed. 2013Feb;5 (2) :294-308)描述了，作為惡病質的分子輸出通路，轉錄因子轉化生長 因子β?刺激的克隆（TSC)22D4的肝臟水平在癌癥惡病質中是增加的。在健康肝臟中模擬 TSC22D4的高惡病質水平導致肝臟VLDL釋放和脂肪生成基因的抑制，以及在正常和高脂肪 的飲食情況下全身VLDL水平的降低。因此，肝臟的TSC22D4活性可能表示患有代謝消耗性 疾病（包括癌癥惡病質）的對象周圍能量不足的分子機理。
[0009]Kulozik,Ph. ,etal.(Hepaticdeficiencyintranscriptional c〇-factorTBLIpromotesliversteatosisandhypertriglycerdemia. 2011Cell Metab. 13:389-400)描述了，轉錄輔助因子轉導素β樣（TBL)-l在肝臟中的受損表達代 表了單基因和多基因脂肪肝小鼠模型的共同特征。在正常和高脂肪的飲食狀況下，健康小 鼠中TBL1基因表達的肝臟特異性消融促進了高甘油三酯血癥和肝臟脂質沉積。由于發現 TBL1表達水平也與人類患者中肝臟脂肪含量負相關，因而肝臟TBL1/TBLR1輔助因子活性 的不足可能代表了患有肥胖和代謝綜合征的對象中的肝臟脂質沉積的分子機理。
[0010] BerrielDiaz,Μ. ,etal.(Nuclearreceptorco-factorRIP140controlslipid metabolismduringwastinginmice. 2008.Hepatology48:782-791)描述了，通過阻止肝 臟TG貯存的調動，肝臟中RIP140的誘導提供了饑餓、敗血癥或癌癥惡病質中的肝臟脂質沉 積的分子機理。因此，肝臟中RIP140轉錄活性的抑制可能在這些病況的治療中提供有吸引 力的輔助方案。
[0011]Fareseetal. (in:Theproblemofestablishingrelationshipsbetween hepaticstreatosisandhepaticinsulinresistance.CellMetab. 2012May2 ； 15(5) :570-3)描述了，肝臟中脂肪的過度沉積（肝臟脂質沉積）經常伴隨肝臟胰島素抵抗。
[0012] 抗糖尿病和/或胰島素敏化藥物的主要種類包括：磺酰尿素酶、二甲雙胍、噻唑烷 二酮、α-葡糖苷酶抑制劑、腸降血糖素模擬物以及二肽基肽酶-4抑制劑，其全部與嚴重 的局限性相關（參見綜述：Moller,Metabolicdiseasedrugdiscovery_〃hittingthe target〃iseasiersaidthandone.CellMetab. 2012Jan4 ; 15 (1):19-24)〇
[0013] 盡管胰島素抵抗在2型糖尿病的發病機制中發揮關鍵作用，仍然缺乏有效和安全 的胰島素增敏劑。確實，當前噻唑烷二酮家族的藥物顯示出中等功效特征并且伴隨很大的 副反應，包括體重增加、心臟衰竭風險增加、膀胱癌風險可能增加以及心肌梗塞風險增加， 例如導致羅格列酮近期退出市場。
[0014] 因此，本發明的目的是提供新型靶標和策略，以預防、治療和/或調節胰島素抵 抗、代謝綜合征和/或糖尿病，和/或增強胰島素敏感性。
[0015] 根據本發明的第一方面，通過鑒定用于預防、治療和/或調節胰島素抵抗、代謝綜 合征和/或I型或2型糖尿病，和/或用于增強胰島素敏感性（例如哺乳動物腫瘤疾病情 況下的胰島素敏感性）的調節劑的方法，上述目的得以實現，所述方法包括下述步驟：a)提 供包含TSC22D4的編碼核酸序列或TSC22D4的基因表達產物的生物樣品，b)將所述樣品與 所述TSC22D4的編碼核酸序列或TSC22D4的基因表達產物的至少一種推定的調節劑接觸， 和c)檢測所述至少一種推定的調節劑與所述TSC22D4的編碼核酸序列或TSC22D4的基因 表達產物的結合，以及d)鑒定所述TSC22D4的編碼核酸序列或TSC22D4的基因表達產物的 所述調節劑。
[0016] 本發明的發明人已經表明，轉錄調節因子轉化生長因子β?刺激的克隆 22D4(TSC22D4)控制肝臟和全身的胰島素敏感性。因此，TSC22D4代表了明確的分子和器 官特異性靶標，其調節胰島素信號級聯反應的一些關鍵節點，從而增強肝臟和全身的胰島 素敏感性并使糖尿病高血糖癥正常化。轉錄TSC22D4復合物作為基于干擾的策略的新型 分子靶標發揮作用，可以操作該策略以增強胰島素敏感性并在糖尿病病況中恢復葡萄糖穩 態。此外，在本發明背景下實施的實驗中，肝臟特異性TSC22D4喪失顯著增強了葡萄糖耐受 和胰島素敏感性，并抵消了高胰島素血癥。TSC22D4復合物被確定為是肝臟和全身胰島素敏 化中的新型分子檢驗點，并且已經開發了敲低策略（由shRNA、siRNA以及miRNA技術介導 的）。在肝臟中用肝臟特異性靶標方法進行TSC22D4操作（例如，基于siRNA的敲低策略） 應該能避免其它組織中的副作用。
[0017] 更詳細地，健康動物中與高通量TSC22D4靶標轉錄組研究相組合的 TSC22D4 (NM_030935)順反組的ChlP-序列分析顯示，胰島素信號通路中的主要節點被 TSC22D4直接或間接靶向，最主要的是脂質運載蛋白13、Grbl4以及S0CS2/3。如為響應急 性胰島素暴露而分別通過將Akt/PKB激酶在Ser473磷酸化和將GSK3β在Ser9磷酸化所 確定的，在原代小鼠肝細胞以及野生型小鼠中TSC22D4的下調或過表達分別導致了細胞內 胰島素信號通路的上調或下調。
[0018] 在糖尿病db/db小鼠中TSC22D4的肝臟失活，增強了這些動物的葡萄糖耐受不良 和胰島素抵抗，并將血糖正常化至基本健康的水平。與糖尿病動物中代謝狀態的整體改善 一致，在肝臟特異性TSC22D4缺乏的小鼠中促炎性細胞因子和抵抗素的循環水平顯著更 低。值得注意的是，肝癌細胞中TSC22D4的失活并未增加細胞生長而是降低了增殖，暗示了 TSC22D4的胰島素敏化功能未導致受影響的細胞/器官中癌癥易感性