臨床用定量檢測髓過氧化物酶試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種過氧化物酶的測定試劑盒，特別是涉及一種用于定量檢測髓過氧 化物酶的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 當前臨床上對急性冠脈綜合征的診斷與評估主要應用心肌酶譜等指標。此類指標 的水平通常會在心肌發生實質損傷后發生明顯升高，因此，該類指標不能對心血管疾病的 發生提供早期預警。髓過氧化物酶是由人中性粒細胞、單核細胞產生的一種有酶活性的血 色素蛋白，其分子量約為118kDa，由一對重鏈和輕鏈組成。通常合成后存于中性粒細胞的嗜 天青顆粒中，但在炎癥條件下可釋放入血，可將氯化物和過氧化氫催化成次氯酸鹽，參與殺 菌效應。但髓過氧化物酶能氧化低密度脂蛋白膽固醇，促進巨噬細胞向泡沫細胞轉化；該蛋 白也可激活金屬蛋白酶（MMPs)，并促進粥樣硬化斑表面失穩定、甚至破裂；可降低NO的含 量及生物利用度，影響其對血管擴張和抗炎功能的效應。近年來的研究表明，髓過氧化物酶 參與了心臟冠脈疾病的發生、發展過程，是急性冠脈綜合征發生的重要原因，其活性的水平 在一定程度反應了冠脈疾病的活化程度。目前，國內各臨床實驗室已認識到髓過氧化物酶 檢測在急性冠脈綜合征診斷中的重要價值，并開始嘗試對其開展檢測，并用于急性冠脈綜 合征等炎癥疾病的診斷。
[0003] 當前對于髓過氧化物酶的檢測主要有二種方法，一種是酶活性檢測方法，即利用 髓過氧化物酶的過氧化物酶活性進行檢測；另一種是利用髓過氧化物酶的抗原性建立的酶 聯免疫檢測法。第一種方法的主要特點是可檢測髓過氧化物酶的活性，但方法靈敏度差、且 多為定性檢測。而酶聯免疫檢測法快速且可定量分析，但常規方法中用辣根過氧化物酶標 記的抗體直接檢測，并采用髓過氧化物酶作為標準品，因此，其檢測靈敏度低；易受髓過氧 化物酶本身過氧化物酶的干擾，特異性差；同時，標準品穩定性差。
【發明內容】
[0004] 本發明要解決的技術問題是提供一種高靈敏、高特異、重復性好、易操作的臨床用 髓過氧化物酶檢測試劑盒。
[0005] 本發明臨床用定量檢測髓過氧化物酶試劑盒，包括抗髓過氧化物酶抗體預包的酶 標板、生物素化抗髓過氧化物酶抗體、親和素化堿性磷酸酶、堿性磷酸酶底物液、髓過氧化 物酶標準品、髓過氧化物酶質控品、樣本稀釋液和酶反應終止液；
[0006] 其中，所述髓過氧化物酶標準品和髓過氧化物酶質控品均為重組的髓過氧化物酶 肽抗原；所述髓過氧化物酶質控品用于校準、擬合標準曲線。
[0007] 進一步，本發明臨床用定量檢測髓過氧化物酶試劑盒，所述抗髓過氧化物酶抗體 預包的酶標板按以下步驟制備：
[0008] 將稀釋的羊抗人髓過氧化物酶多抗加入96孔聚苯乙烯酶標板中，孵育8-12小時； 將抗體吸出后，用洗滌緩沖液洗加樣孔三遍；加入封閉液靜置4小時；棄去孔中液體，冷風 機吹干后，真空包裝，置4°C保存；
[0009] 所述稀釋的羊抗人髓過氧化物酶多抗，濃度為10yg/mL;
[0010] 所述洗滌緩沖液為加〇? 08 %吐溫-20的0?ImM磷酸緩沖液，pH為7. 4 ;
[0011] 所述封閉液為含5%牛白蛋白和5%人白蛋白的pH7. 4的0.ImM磷酸緩沖液，以上 所述百分數均為質量百分數。
[0012] 更進一步，本發明臨床用定量檢測髓過氧化物酶試劑盒，所述羊抗人髓過氧化物 酶多抗為髓過氧化物酶全蛋白免疫羊后，純化、制備的多抗。
[0013] 進一步，本發明臨床用定量檢測髓過氧化物酶試劑盒，所述生物素化抗髓過氧化 物酶抗體按以下步驟制備：
[0014] 將兔抗人髓過氧化物酶多抗采用N-羥基丁二酰亞胺（生物素）進行偶聯標記；用 磷酸緩沖液透析去除游離生物素后，即制得生物素化抗髓過氧化物酶抗體；
[0015] 將制得的生物素化抗髓過氧化物酶抗體用含20%甘油、10%牛白蛋白、0. 5%海藻 酸鈉和0. 05 %疊氮鈉的0.IM磷酸緩沖液按I:20-200稀釋，-20 °C保存；
[0016] 所述磷酸緩沖液pH為7. 4,以上百分數均為質量百分數。
[0017] 進一步，本發明臨床用定量檢測髓過氧化物酶試劑盒，所述親和素化堿性磷酸酶 按以下步驟制備：
[0018] 將堿性磷酸酶用鏈霉親和素采用戊二醛法進行標記；透析去除游離鏈霉親和素 后，即制得親和素化堿性磷酸酶；
[0019] 將制得的親和素化堿性磷酸酶用含20%甘油、10%牛白蛋白、0. 5%海藻酸鈉和 0. 05%疊氮鈉的0.ImM磷酸緩沖液按1:20-200稀釋，-20°C保存；
[0020] 所述磷酸緩沖液pH為7. 4,以上所述百分數均為質量百分數。
[0021] 進一步，本發明臨床用定量檢測髓過氧化物酶試劑盒，所述堿性磷酸酶底物液按 以下步驟制備：將PNPP以IOmM的濃度溶于含ImM1%(：12的0.IM二乙醇胺緩沖液（pH9. 8) 中，即制得堿性磷酸酶底物液。
[0022] 進一步，本發明臨床用定量檢測髓過氧化物酶試劑盒，所述樣本稀釋液為含0. 5% 牛白蛋白的〇.ImM磷酸緩沖液，pH為7. 4。
[0023] 進一步，本發明臨床用定量檢測髓過氧化物酶試劑盒，所述酶反應終止液為3N的 NaOH0
[0024] 進一步，本發明臨床用定量檢測髓過氧化物酶試劑盒，所述髓過氧化物酶標準品 的濃度分別為 30ng/mL、15ng/mL、7. 5ng/mL、3. 75ng/mL、l. 87ng/mL。
[0025] 進一步，本發明臨床用定量檢測髓過氧化物酶試劑盒，所述生物素化抗髓過氧化 物酶抗體和親和素化堿性磷酸酶應用的稀釋比均為1:2000,稀釋液均為含20%甘油、10% 牛白蛋白、〇. 5 %海藻酸鈉和0. 05 %疊氮鈉的0.ImM磷酸緩沖液，所述磷酸緩沖液pH為 7. 4,以上所述百分數均為質量百分數。
[0026] 本發明臨床用定量檢測髓過氧化物酶試劑盒與現有技術不同之處在于：
[0027] 1、本發明的臨床用定量檢測髓過氧化物酶試劑盒中采用堿性磷酸酶作為標記物， 替代常規方法中的辣根過氧化物酶，避免了髓過氧化物酶本身的干擾，提高了檢測的特異 性；本發明在檢測體系中采用生物素-親和素增敏系統整合，提高了檢測靈敏度；同時，標 準品采用重組髓過氧化物酶肽，由于重組髓過氧化物酶肽表位比較單一，結合特異性更好， 因此提高了標準品檢測的重復性和定量檢測的穩定性，降低了成本。
[0028] 2、經實驗驗證本發明試劑盒的檢測區間為0. 233-30ng/ml;無論是高濃度樣本， 還是低濃度樣本，其批內CV值均小于7%，方法學精密度良好；試劑盒的回收效率平均為 101. 39%，說明準確度良好。
[0029] 下面結合附圖和實施例對本發明的臨床用定量檢測髓過氧化物酶試劑盒作進一 步說明。
【附圖說明】
[0030] 圖1為本發明臨床用定量檢測髓過氧化物酶試劑盒的技術原理圖；
[0031] 圖2為本發明實施例2中采用不同包被抗體濃度的檢測結果曲線圖；
[0032] 圖3為本發明實施例3中采用不同檢測抗體濃度的檢測結果曲線圖；
[0033] 圖4為本發明實施例4中采用不同堿性磷酸酶濃度的檢測結果曲線圖；
[0034] 圖5為本發明實施例5中采用不同抗原和標準品的孵育時間的檢測結果曲線圖；
[0035] 圖6為本發明臨床用定量檢測髓過氧化物酶試劑盒對髓過氧化物酶的檢測區間 圖。
【具體實施方式】
[0036] 實施例1
[0037] 本實施例的臨床用定量檢測髓過氧