Stim1蛋白在相關疾病風險診斷中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥生物技術領域，具體涉及SHM1蛋白在診斷與血小板在內皮細胞 暴露的外基質上粘附、激活或聚集相關的疾病風險的藥物的制備中的用途以及用于所述用 途的酶聯免疫試劑盒。
【背景技術】
[0002] 血小板，是一類無核細胞，是由骨髓中的巨核通過一個復雜的過程釋放出。血小 板的激活和聚集是血管損傷后保護機體的重要生理過程，這個過程是一個多步驟的級聯 反應過程。但是這項生理過程也成為很多血管疾病例如血栓形成主要原因。血小板粘 附、激活以及聚集到內皮細胞暴露的外基質可引起止血反應，同時會導致血栓形成。血 小板活化的始動因素是細胞內游離鈣離子濃度上升，而由基質相互作用分子1(Stromal interactionmolecules1，STIM1)和細胞膜蛋白Orail所構成的庫操控的|丐通道 (store-operatedcalciumchannels，S0CC)便是血小板激活的主要通路之一[Progress inPhysiologicalSciences, 2012, 43:417-421]。STIM1 高表達于血小板，研究發現，敲除 SHM1后的小鼠與野生型小鼠相比，表現出更高的出生后致死率和明顯的發育遲緩[JExp Med, 2008, 205, 1583-1591]。在高剪切力下，與正常組小鼠相比敲除SHM1組小鼠的血小板 表現出黏附能力減弱、血栓覆蓋率減弱、血栓體積減小[JExpMed，2008, 205, 1583-1591]。 STIM1和Orail共同參與GPVI誘導的庫操控的|丐流入（store-operatedCa2+entryS0CE)、 凝血酶源激活和血栓形成[JBiolChem，2010, 285, 23629-23638]。敲除SHMl的血小板可 以顯著抑制血小板膠原受體糖蛋白VI依賴性鈣信號，導致磷脂酰絲氨酸（血小板凝血活性 所必需成分）的暴露減少，從而抑制血栓形成[JExpMed, 2008, 205, 1583-1591]。由此可 見，SHM1在血栓形成的過程中起著至關重要的作用。
[0003] 缺血性腦卒中（cerebralischemicstoke)是指腦部血流循環障礙，缺血、缺氧所 致的局限性腦組織的缺血性壞死或軟化。缺血性腦卒中主要包括腦血栓形成和腦栓塞兩 種，而血管壁病變、血管壓迫、心臟疾病、血流動力學改變以及血液成分的改變等均可引發 缺血性腦卒中。缺血性腦卒中的臨床表現比較復雜，取決于梗死部位和梗死體積，主要以局 灶性神經功能缺損的癥狀和體征為特征，如偏癱、偏身感覺障礙、失語、共濟失調等，還有部 分可表現為頭痛、嘔吐、昏迷等全腦癥狀。依據2010年全球疾病負擔研究（GBD2010)結果 顯示（NEnglJMed, 2013, 369:448-457)，腦卒中已經成為一個全球性的健康問題，是影響 壽命、導致傷殘第3位的原因。根據相關部門最新統計顯示，我國每年新發腦卒中患者250 萬人，并以每年8. 7%的速度上升，目前腦卒中患者至少700萬人，致殘率高達75%，已成 為中國第一的死亡原因。腦卒中主要分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩大類，在一些發 達國家中，高達67. 3%~80. 5 %的腦卒中病例歸因于缺血性腦卒中，而根據我國衛生部統 計，缺血性腦卒中占腦卒中病人總數的45. 5% -75. 9%。目前，由于社會壓力和生活習慣的 影響，青年人群的發病率逐年增加。每年由腦卒中造成的直接和間接經濟損失高達數百億 元。因此，腦卒中不僅是醫學難題，更是不容忽視的社會問題。
[0004] 因此，本領域中存在對在人群中診斷與血小板在內皮細胞暴露的外基質上粘附、 激活或聚集相關的疾病風險的需要，即存在對患有所述疾病的風險的診斷、所述疾病嚴重 程度的診斷和/或所述疾病預后恢復的診斷的需要。這對相關疾病的預測、預防具有重要 的臨床意義和社會經濟效益。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種診斷與血小板在內皮細胞暴露的外基質上粘附、激活 或聚集相關的疾病風險的簡單快捷的方法以及相關藥物。
[0006] 在第一方面，本發明提供了SHM1蛋白在診斷與血小板在內皮細胞暴露的外基質 上粘附、激活或聚集相關的疾病風險的藥物的制備中的用途。
[0007] 在本發明的實施方案中，所述疾病可以是血栓，優選地為腦血栓，更優選地為腦血 栓引起的缺血性腦卒中風。
[0008] 在本發明的實施方案中，所述診斷可以包括患有所述疾病的風險的診斷、所述疾 病嚴重程度的診斷和/或所述疾病預后恢復的診斷。
[0009] 在本發明的實施方案中，所述診斷可以通過測定外周血中血小板內SHM1蛋白的 含量進行，優選地通過酶聯免疫檢測進行。
[0010] 在本發明的實施方案中，所述藥物可以包含所述SHM1蛋白的抗體，優選地包含 捕獲抗體A和/或酶標檢測抗體B。
[0011] 在本發明的實施方案中，所述藥物可以包括試劑盒，優選地，所述試劑盒為酶聯免 疫試劑盒。
[0012] 在第二方面，本發明提供了用于如第一方面所述的用途的酶聯免疫試劑盒，所述 試劑盒包含所述SHM1蛋白的捕獲抗體A和所述SHM1蛋白的酶標檢測抗體B。
[0013] 在本發明的實施方案中所述捕獲抗體A和所述酶標檢測抗體B可以通過以下方法 制備：
[0014] (1)單克隆細胞制備：將表達純化的所述SHM1蛋白與等體積的弗氏佐劑、 Y0UL0NG佐劑混合乳化均勻，成油包水狀態，免疫4只Balb/c小鼠，皮下免疫3次，間隔4 周，最后經ELISA檢測；最后一次免疫后兩周，腹腔注射抗原進行加強免疫，三天后，將小鼠 處死，得到脾細胞，加入SP2/0骨髓瘤細胞，在PEG4000的作用下進行細胞融合；將融合好的 細胞鋪進96孔板，用HAT培養液進行培養，三天后用HT培養液培養，10天后，取細胞培養 上清進行檢測得到陽性孔；使用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，10天后檢測，將陽性克 隆繼續有限稀釋法進行克隆化，直到得到的克隆都為陽性，從而建立不少于50株陽性細胞 株；
[0015] (2)單克隆抗體制備與純化：在小鼠腹腔注射礦物油，一周后將所獲得的陽性細 胞株細胞注射入小鼠腹腔，10天左右收集腹水；于4000rpm室溫離心腹水15min，取上清， 在4°C攪拌下逐滴緩慢加入飽和硫酸銨至半飽和，繼續攪拌30min，于13000rpm，4°C離心 30min，棄上清；將沉淀溶于0. 01M，pH7. 4的PBS;在4°C攪拌下逐滴緩慢加入飽和硫酸銨至 33%，繼續攪拌30min，于13000rpm，4°C離心30min，棄上清；沉淀溶于0? 01M,pH7. 4的PBS， 4 °C透析過夜；
[0016] (3)配對篩選：將純化后的單克隆抗體作為包被抗體，用pH9. 6的碳酸鹽緩沖液按 照1:100倍稀釋，100yL/孔加至多孔板，4°C包被過夜；洗液（含0. 2%吐溫-20的PBS)清 洗包被板3次，每次洗液用量300uL，時間為lmin，用PH9. 6的碳酸鹽緩沖液按照1:9倍稀 釋10%羊血清進行封閉，每孔15〇yL，恒溫37°C封閉3小時；加入濃度梯度為1000、100、 10、0ppb的SHM1蛋白溶液，加入陰性對照，100yL/孔，25°C，溫育45min;洗液清洗包被板 3次，每次洗液用量300uL，時間為lmin;將得到的單克隆抗體，逐一常規標記辣根過氧化物 酶作為檢測抗體，用稀釋液按1 :1000比例稀釋，充分混勻，每孔100y1，25°C，溫育45min; 洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300yL，時間為lmin，每孔加TMB100yL，25°C反應 15min;加入2M的H2S04,100yL/孔，450nm讀取吸光度值，選擇結合信號最強的一對包被抗 體和檢測抗體分別作為用于所述試劑盒的所述捕獲抗體A和所述酶標檢測抗體B。
[0017] 在本發明的實施方案中，所述試劑盒還可以包括：包被緩沖液，0. 1M碳酸鹽緩沖 液CB，pH值為9. 6 ;稀釋液，0.OlmM磷酸鹽緩沖液PBS，pH值為7. 4 ;洗滌液，含0. 2 %吐 溫-20的PBS;封閉液含1 %BSA的CB;和終止液，2M的H2S04。
[0018] 有益效果：
[0019] 本發明的發明人發現人外周血中血小板內SHM1蛋白的表達水平與血小板在內 皮細胞暴露的外基質上粘附、激活或聚集相關的疾病具有正相關管轄，并由此提供了一種 通過定量分析人外周血中血小板內SHM1蛋白的表達水平診斷與血小板在內皮細胞暴露 的外基質上粘附、激活或聚集相關的疾病風險的方法，這種方法操作簡便，能準確診斷多種 疾病例如腦血栓、缺血性腦卒中等疾病的患病風險、疾病嚴重度以及預后風險等。
【附圖說明】
[0020] 通過以下參照附圖對本發明實施例的描述，本發明的上述以及其它目的、特征和 優點將更為清楚，在附圖中：
[0021] 圖1為根據本發明的實施方案中，所測定的標準品的0D值的標準曲線。
【具體實施方式】
[0022] 以下基于實施例對本發明進行描述，但是本發明并不僅僅限于這些實施例。
[0023] 實施例1 :抗體制備
[0024] 1材料
[0025] 1. 1試劑
[0026]BL21 (DE3)原核表達宿主菌、LB培養基、卡那抗生素、高親和性NI樹脂、瓊脂糖凝 膠、咪唑、尿素、NaCl、SDS、過硫酸銨、TEMED、丙烯酰胺、考馬斯亮藍、BCA蛋白濃度測定試劑 盒、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑等。
[0027] 1. 2 儀器
[0028] 高壓滅菌鍋、恒溫搖床、冷凍離心機、超聲破碎儀、蛋白純化儀、恒溫培養箱、蛋白 電泳設備、恒溫攪拌器、渦旋儀、酶標儀等。
[0029] 2 方法