一種重金屬定量檢測系統以及定量檢測重金屬的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種重金屬定量檢測系統以及定量檢測重金屬的方法。
【背景技術】
[0002] 隨著我國經濟的快速發展和生活水平的提高，人們再對食品安全有了更高的要求 同時，由于我國在市場經濟建設過程中由于制度建設和監管水平等多種原因導致我國食品 安全問題日益嚴重。引起食品安全問題的原因很多，重金屬超標問題是影響食品安全的重 要因素之一。目前，重金屬如銅、鉛、鋅、鐵、鈷、鎳、錳、鎘、汞、鎢、鉬、金、銀等。現階段對我 們人類和環境造成危害的重金屬有以下幾種元素：汞、鎘、鉛、鉻、銅以及類金屬砷等生物毒 性顯著的重金屬元素。
[0003] 如果重金屬元素未經處理就直接排入河流、湖泊或海洋，或者進入土壤中，由于 它們不能被生物降解而使這些河流、湖泊、海洋和土壤受到污染。在食物鏈的生物放大作用 下，它們成千百倍地富集，最后進入人體。如魚類或貝類積累的重金屬被人類所食，或重 金屬被稻谷、小麥等農作物吸收后被人類食用，重金屬就會進入人體，使人產生重金屬中 毒，輕則發生怪病（水俁病、骨痛病等），重則導致死亡。其次，重金屬在人體內能和蛋白 質及酶等發生強烈的相互作用，使它們失去活性，也可在人體的某些器官中累積，造成慢 性中毒，重金屬超標引起的中毒事件不勝枚舉。對于水體和土壤中的重金屬污染，現在還 沒有很好的辦法，因為存在于水和土壤中的重金屬很難降解，并且還具有富集性，所以重金 屬的污染是不可逆轉的。
[0004] (1)鉛：是可在人體和動物組織中積蓄的有毒金屬。它是通過皮膚、消化道、呼吸 道進入體內與多種器官親和，主要毒性效應是貧血癥、神經機能失調和腎損傷，易受害的人 群有兒童、老人、免疫力低下人群。
[0005] (2)鎘：不是人體的必需元素，可通過食物鏈富集作用危害人類健康，對人體多系 統具有毒性作用，聯合國糧農組織和世界衛生組織將Cd2+列為第三位優先研究的食品污 染物。鎘的毒性很大，可在人體內積蓄，主要積蓄在腎臟，引起泌尿系統的功能變化；鎘能夠 取代骨中鈣，使骨骼嚴重軟化，骨頭寸斷，會引起胃臟功能失調，干擾人體和生物體內鋅的 酶系統，導致高血壓癥上升。易受害的人群是礦業工作者、免疫力低下人群。
[0006] (3)汞：萊及其化合物屬于劇毒物質，可在人體內蓄積。血液中的金屬汞進入腦組 織后，逐漸在腦組織中積累，達到一定的量時就會對腦組織造成損害，另外一部分汞離子轉 移到腎臟。進入水體的無機汞離子可轉變為毒性更大的有機汞，由食物鏈進入人體，引起全 身中毒作用；易受害的人群有女性，尤其是準媽媽、嗜好海鮮人士；天然水中含汞極少，一 般不超過0? 1yg/L。
[0007] (4)砷：是人體的非必需元素，元素砷的毒性極低，而砷的化合物。均有劇毒，三價 砷化合物比其它砷化合物毒性更強。砷通過呼吸道、消化道和皮膚接觸進入人體，如攝入量 超過排泄量，砷就會在人體的肝、腎、肺、脾、子宮、胎盤、骨胳、肌肉等部位蓄積，與細胞中的 酶系統結合，使酶的生物作用受到抑制失去活性，特別是在毛發、指甲中蓄積，從而引起慢 性砷中毒，潛伏期可達幾年甚至幾十年，慢性砷中毒有消化系統癥狀、神經系統癥狀和皮膚 病變等。砷還有致癌作用，能引起皮膚癌。地面水中含砷量因水源和地理條件不同而有很 大差異，淡水平均為0. 5ym/L，海水為3. 7ym/L。
[0008] (5)鉻：如誤食飲用，可致腹部不適及腹瀉等中毒癥狀，引起過敏性皮炎或濕疹， 呼吸進入，對呼吸道有刺激和腐蝕作用，引起咽炎、支氣管炎等。水污染嚴重地區居民，經常 接觸或過量攝入者。易得鼻炎、結核病、腹瀉、支氣管炎、皮炎等
[0009] (5)銅：過量銅在人體內富集，會出現惡心、嘔吐、上腹疼痛、急性溶血和腎小管變 形等中毒現象，嚴重者還可導致急性腎衰等危害。銅粉塵可引起咽痛、咳嗽和咯痰，甚至 胸悶氣憋，發冷發燒。
[0010] 目前常規重金屬檢測方法有原子熒光光度法（AFS)、電感藕合等離子體質譜 (ICP-MS)分析技術、電感藕合等離體原子發射光譜（ICP-AES)、高效液相色譜法等。在當前 眾多應用于重金屬離子檢測的分析技術中，原子吸收光譜法是最常用的方法，該方法通常 有較高的靈敏度，但成本較高、需要專業技術人員操作、獲得較高的靈敏度需要較大的樣本 容量且由于樣本必須依次分析而耗時較長。因此，不能滿足當前大批量樣品快速，簡便和適 于現場檢測的需求。
[0011] 免疫分析法是一種具有高度特異性和靈敏度的分析方法，重金屬檢測主要有有 間接競爭性ELISA法和膠體金快速免疫層析法。采用免疫層析法檢測時，需要用膠體金顯 色。
[0012] 膠體金是由氯金酸（HAuC14)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用 下，可聚合成一定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，形成帶負電的 疏水膠溶液，由于靜電作用而成為穩定的膠體狀態，故稱膠體金。
[0013] 免疫分析法利用抗原抗體特異性結合反應，使標記抗體的顯色劑顯色，而檢測各 種物質（藥物、激素、蛋白質、微生物等）的分析方法。膠體金在弱堿環境下帶負電荷，可與 抗體的正電荷基團結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響抗體的生物特性。因而利用 膠體金進行免疫分析時，具有方便快捷不需要特殊設備和試劑、結果判斷直觀等優點，得到 廣泛使用。
[0014] 然而，由于膠體金只有在弱堿性環境下才能與抗體有效結合，一旦檢測對象的pH 不是弱堿性的，則無法準確檢測，而重金屬的檢測需要用強酸提取，雖然通過增加稀釋倍數 的方式可以勉強檢測，但是檢測結果不準確。
[0015] 中國專利申請CN201010229009. 1公開了一種重金屬汞抗體制備及酶聯免疫吸附 法測定重金屬含量的方法，可以用來檢測重金汞，但是該方法準確性查，而且操作復雜，需 要專業大型設備。中國專利申請CN201020521531. 2公開了一種重金檢測卡，該檢測卡只能 再特殊環境中進行檢測，而且只能定性檢測，無法定量檢測是。
[0016] 因此市面上需要一種能夠快速、準確定量檢測重金屬，而且方便攜帶的檢測系統。
【發明內容】
[0017] 本發明的目的在于提供一種重金屬定量檢測系統。
[0018] 首先，本發明提供了一種改性膠體金的制備方法，它包括如下步驟：
[0019] (1)取直徑為10~60nm的膠體金溶液100份，加入膠體金溶液體積的0? 1~3% 的二（三乙醇胺）鈦酸二異丙酯溶液，二（三乙醇胺）鈦酸二異丙酯溶液的濃度為1%， 100~400r/min下攪拌0. 5~2h，得混合溶液；
[0020] (2)調節上述混合溶液pH值至8~10,加入0. 1~2份鈦酸正丁酯，在室溫下以 100~400r/min攬摔反應24~36小時，在4000~16000r/min條件下離心5~60min，吸 出上清液加入超純水或緩沖液清洗，重復1~2次，即制備得表面含有活性-0H的鈦酸酯改 性的膠體金顆粒。
[0021] 步驟（1)中，所述膠體金溶液采用氯金酸一檸檬酸三鈉還原法制備。
[0022] 步驟⑵中，調混合溶液pH值采用氨水調節。
[0023] 本發明還提供了前述方法制備的改性膠體金。
[0024] 本發明還提供了一種金標抗體的制備方法，步驟如下：取前述的改性膠體金，加入 抗體，膠體金表面活性-0H與抗體Fc段-C00H反應形成穩定鍵合，形成金標抗體。
[0025] 優選地，所述抗體是Cd單克隆抗體、Pb單克隆抗體、Hg單克隆抗體、As單克隆抗 體、Cr單克隆抗或Cu單克隆抗體。
[0026] 本發明還提供了前述方法制備的金標抗體。
[0027] 本發明還提供了前述改性膠體金或者前述金標抗體在免疫膠體金檢測中的用途。
[0028] 優選地，所述免疫膠體金檢測是免疫膠體金光鏡染色、免疫膠體金電鏡染色、膠體 金免疫層析。
[0029] 本發明檢測重金屬的膠體金免疫層析試劑盒：它包括檢測試紙和卡殼，試紙置于 卡殼中；所述檢測試紙包括塑料底板1，一端粘貼上樣品墊2,上樣品墊的一端緊密壓接著 含有所檢測重金屬相對應抗體所標記的金標制作的膠體金墊3,膠體金墊3 -端緊密壓接 著硝酸纖維素膜4,硝酸纖維素膜上包被有檢測線T和質控線C5,檢測線T包被著待檢重金 屬的完全抗原，質控線C上包被有抗鼠IgG抗體，硝酸纖維素膜另一端連接吸樣墊6 ;所述 卡殼表面對應樣品墊2的位置設有加樣孔7,卡殼表面對應硝酸纖維素膜4的位置設有觀察 口 8;其中，膠體金墊上的膠體金為前述方法制備的改性膠體金。
[0030] 優選地，所述膠體金墊上的金標抗體為前述方法制備的金標抗體。
[0031] 優選地，所述重金屬的完全抗原是重金屬與絡合劑絡合后，與載體蛋白相偶聯形 抗原，其中，所述絡合劑是檸檬酸、乙二胺四乙酸、氨基乙酸、1_(4_異硫氰芐基）乙烯基二 胺-N，N，N'，N' -四乙酸、二乙烯三胺五羧酸鹽、谷胱甘肽和有機多齒配體中的一種或多種； 所述載體蛋白是牛血清白蛋白、匙孔血藍蛋白、卵清蛋白、人血清蛋白中的一種或多種。
[0032] 優選地，所述硝酸纖維素膜是孔徑5-12微米的多孔樣結構膜，所述樣品墊為玻璃 纖維素膜或聚酯膜，所述吸樣紙為吸水濾紙。
[0033] 本發明還提供了一種檢測重金屬的檢測系統，它包括前述所述的膠體金免疫層析 試劑盒、干式恒溫儀和膠體金讀數儀，其中，膠體金讀數儀是一種手持式膠體金讀數儀。
[0034] 本發明還提供了一種檢測重金屬的方法，它是前述的檢測系統進行檢測。
[0035] 優選地，它包括如下步驟：
[0036] 1)使用粉碎機粉碎所需檢測樣品，并過20目篩網。
[0037] 2)取待檢樣品，加入2~8倍mL/g的提取劑，在震蕩頻率為2~60cpm條件下反 應5~30min，過濾，取上清，加入上清2~40倍體積的稀釋液，混勻，得混合液；所述提取 劑是濃度為1~15%的硝酸溶液；所述稀釋劑為添加有表面活性劑、重金屬絡合劑的緩沖 溶液；
[0038] 3)將前所述的膠體金免疫層析試劑盒和步驟1)制備的混合液分別放入干式恒溫 儀中，恒溫2~15min，溫度設定為20~45°C;
[0039] 4)在干式恒溫儀中，將步驟1)制備的混合液加入試劑盒的加樣孔中，恒溫反應 5 ~30min;
[0040] 5)將反應后的試劑盒，置于膠體金讀數儀中，讀取數據即可。
[0041] 進一步優選地，它包括如下步驟：
[0042] 1)取待檢樣品，加入4倍mL/g的提取劑，在震蕩頻率為2~60cpm條件下反應 5min，過濾，取上清，加入上清4倍體積的稀釋液，混勻，得混合液；所述提取劑是濃度為 10%的硝酸溶液；所述稀釋劑為添加有1%tWeen20,1X10 7ITCBEg/mL的0?2MPBS溶液；
[0043] 2)將前述的膠體金免疫層析試劑盒和步驟1)制備的混合液分別放入恒溫裝置 中，恒溫5min，溫度設定為37°C;
[0044] 3)在恒溫裝置中，將步驟1)制備的混合液加入試劑盒的加樣孔中，恒溫反應 20min；
[0045] 4)將反應后的試劑盒，置于膠體金讀數儀中，讀取數據即可。
[0046] 本發明改性膠體金是表面含有活性-0H的鈦酸酯改性的膠體金顆粒，其與抗