Psmd4蛋白的elisa檢測試劑盒及其檢測方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于免疫學和生物技術領域，具體涉及一種PSMD4蛋白的ELISA檢測試劑 盒及其檢測方法與在肝癌血清學診斷中的應用。
【背景技術】
[0002] 原發性肝細胞肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC)是我國最常見惡性腫瘤之 一，每年新發病例約占全球50 %。由于肝癌出現癥狀時多屬中晚期，切除后復發、轉移率高。 因此，肝癌的早期診斷對延長患者的生存時間和降低肝癌死亡率具有重要意義。
[0003] 目前肝癌的診斷主要依靠實驗室檢查、影像學檢查以及肝穿刺組織學檢查。影 像學診斷在肝癌診斷中起重要作用，但在診斷小于2公分的小肝癌及區分良惡性結節方 面具有一定的局限性。有創的組織病理學檢查是診斷肝癌的金標準，但細針穿刺因取材 有限而有較高的假陰性率，并且有使腫瘤擴散和針道種植的風險。臨床上，血清甲胎蛋白 (a-fetoprotein，AFP)是目前唯一廣泛應用的HCC標志物。但是近年研究報道，以AFP診斷 HCC的陽性率僅為60% -70%，在小肝癌中敏感性更低，容易造成漏診；其次在一些良性肝 病、生殖性畸胎瘤等患者中也可有升高，容易造成誤診。因此，臨床仍需要高度敏感的血清 肝癌特異標志物來鑒別肝臟良惡性病變，或在高危人群進行隨訪提高肝癌的早期診斷率。
[0004]HCC血清標志物的研究一直是科學家們研究的重點，但大多數研究成果難以滿足 實際應用的需要。探索高敏感性及特異性的血清學指標尤為重要。
[0005] 本發明中的研究對象一PSMD4蛋白，是一個蛋白酶體26S非ATP酶亞基 4(GeneID:5710)。該分子含有兩段15個氨基酸的泛素相互作用模序（ubiquitin interactingmotif,UIM)，能夠選擇性結合泛素化蛋白，介導蛋白質降解。已有研究報 道，PSMD4異常表達與炎癥性腸病、潰瘍性結腸炎等疾病相關，PSMD4在肝癌中的表達及 生物學功能尚不十分清楚。有研究顯示，PSMD4可能與細胞分化和機體發育有關（參 見文南犬：Smalle,J,etal.Thepleiotropicroleofthe26Sproteasomesubunit RPN10inArabidopsisgrowthanddevelopmentsupportsasubstrate-specific functioninabscisicacidsignaling.PlantCell,2003. 15 (4) :p. 965-80.； Szlanka，T，etal.DeletionofproteasomalsubunitS5a/Rpnl0/p54causes lethality,multiplemitoticdefectsandoverexpressionofproteasomalgenesin Drosophilamelanogaster.JCellSci，2003. 116(Pt6) :p. 1023-33. ;Hamazaki，J.，et al.,Rpnl〇-mediateddegradationofubiquitinatedproteinsisessentialformouse development.MolCellBiol，2007.27(19):p.6629-38)。我們發現PSMD4 是一個重要的肝 癌癌蛋白，并且可以釋放入血。本申請人已就PSMD4作為肝癌預后診斷標志物的新用途申 請了中國專利CN201310005491. 4,發明名稱為"PSMD4蛋白在制備肝癌預后評估試劑盒中 的應用"，公開號為CN103091493A。
[0006] 目前尚無文獻報道在肝癌血清樣品中準確檢測到PSMD4蛋白；也尚無針對肝癌血 清樣品中的PSMD4蛋白含量提供一種準確、簡便、靈敏度高的檢測手段；也尚無文獻報道 PSMD4蛋白的ELISA檢測試劑盒以及該類試劑盒在肝癌血清學診斷中的應用。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供一種PSMD4蛋白的ELISA檢測試劑盒；本發明的另一目的是 提供利用上述試劑盒的檢測方法；本發明的第三目的是提供上述試劑盒在肝癌血清學診斷 中的應用。
[0008] 本發明旨在為臨床和實驗室肝癌血清樣品中PSMD4蛋白含量提供準確、簡便、靈 敏度高、并可被廣泛使用的檢測手段。
[0009] 本發明人經過廣泛而深入的研究，采用酶聯免疫吸附法檢測PSMD4蛋白在肝癌病 人血清中的表達水平，并首次證實在肝癌病人的血清中存在PSMD4蛋白。
[0010] 本發明第一方面，提供了一種PSMD4蛋白的ELISA檢測試劑盒，所述的ELISA檢測 試劑盒包括：
[0011] (1)包被有PSMD4抗體的ELISA酶標板，所述的包被抗體為兔抗人PSMD4的多克 隆抗體；較優的，兔抗人PSMD4的多克隆抗體購自PTG公司；最優的，抗體工作濃度為2yg/ ml〇
[0012] (2)檢測PSMD4抗原的抗體，為小鼠抗人PSMD4的單克隆抗體；較優的，小鼠抗人 PSMD4的單克隆抗體購自PTG公司；最優的，檢測抗體的工作濃度為0. 5yg/ml。
[0013] (3)酶標二抗，HRP(辣根過氧化物酶）標記的山羊抗小鼠IgG;較優的，HRP標記 的山羊抗小鼠IgG購自PTG公司；最佳的，稀釋濃度為1:5000。
[0014] (4)標準蛋白，為重組人PSMD4融合蛋白；較優的，重組人PSMD4融合蛋白購自PTG 公司。
[0015] (5)所述的試劑盒，還包括有：常規的樣品稀釋液、包被緩沖液、封閉液、ELISA酶 標板洗滌液、抗體稀釋液、顯色液和終止液；
[0016] 所述的試劑盒，ELISA酶標板為市售的ELISA酶標板，優選德國greiner公司的 ELISA酶標板（96孔單條可拆酶標板#650180);
[0017] 包被緩沖液，選用IXPBS，pH: 7. 4;
[0018] 封閉液，選用含3 %牛血清白蛋白+PBS溶液的封閉液；
[0019]ELISA酶標板洗滌液，較優的為含0? 05%Tween-20的1XPBS溶液；
[0020] 樣品稀釋液：樣品為血清時，較優的為1XPBS，pH: 7. 4;
[0021] 抗體稀釋液，選用1XPBS;
[0022] 顯色液，選用sigam公司的3, 3'，5, 5'-四甲基聯苯胺（TMB);
[0023] 終止液，較優的為2mol/L的硫酸溶液。
[0024] 本發明所述的一種PSMD4蛋白的ELISA檢測試劑盒，所用的試劑、條件進一步優 化：
[0025](1)包被抗體的優化：本發明的試劑盒，分別選用不同的抗體包被：兔抗人PSMD4 的多克隆抗體（Abnova公司，#H00005710-AP11-1)、兔抗人PSMD4的多克隆抗體（PTG公司， #14899-1-AP)，鼠抗人PSMD4 的單克隆抗體（Abnova公司，#H00005710-APll-2)、鼠抗人 PSMD4 的單克隆抗體（PTG公司，#66179-1-Ig)，檢測濃度選用 7. 5yg/ml，5yg/ml，2. 0yg/ ml，1yg/ml，0. 5yg/ml，0. 25yg/ml。結果發現選用兔抗人PSMD4的多克隆抗體（Abnova公 司，#H00005710-AP11-1)、鼠抗人PSMD4 的單克隆抗體（Abnova公司，#H00005710-APll-2 ;PTG公司，#66179-1-Ig)作為包被抗體均存在明顯的非特異反應，標準品的濃度和吸光度 數值沒有相關性；但是使用兔抗人PSMD4的多克隆抗體（PTG公司，#14899-1-AP)則沒有明 顯的非特異性反應，標準品的濃度和吸光度具有較好的相關性。經過反復優化，抗體工作濃 度2yg/ml為最佳，標準品的濃度和吸光度數值的相關性最好。
[0026] (2)檢測抗體的優化：本發明的試劑盒，分別選用不同的抗體作為檢測抗體：當 包被抗體為兔抗人PSMD4的兩種多克隆抗體（Abnova公司；#H00005710-AP11-1 ;PTG公司， #14899-1-AP)時選用鼠抗人PSMD4的兩種單克隆抗體（Abnova公司，#H00005710-APll-2 ; PTG公司，#66179-1-Ig)分別作為檢測抗體；當包被抗體為鼠抗人PSMD4的兩種單克隆抗體 (Abnova公司，#H00005710-APll-2;PTG公司，#66179-1-Ig)時選用兔抗人PSMD4 的兩種多 克隆抗體（Abnova;#H00005710-AP11-1;PTG公司，#14899-1-AP)。檢測濃度選用 2. 0yg/ ml，1yg/ml，0. 5yg/ml，0. 25yg/ml，0. 1yg/ml。結果發現包被抗體兔抗人PSMD4 的多克 隆抗體（Abnova公司；#H00005710-AP11-1)與鼠抗人PSMD4的兩種單克隆抗體（Abnova公 司，#H00005710-APll-2 ;PTG公司，#66179-1-Ig)配伍時呈現明顯的非特異反應，標準品的 濃度和吸光度數值沒有相關性；兔抗人PSMD4的多克隆抗體（PTG公司，#14899-1-AP)與鼠 抗人PSMD4的單克隆抗體（Abnova公司，#H00005710-APll-2)配伍時同樣存在明顯非特異 反應，標準品的濃度和吸光度數值沒有相關性；分別將兩種包被抗體鼠抗人PSMD4的單克 隆抗體（Abnova公司，#H00005710-APll-2;PTG公司，#66179-1-Ig)與兔抗人PSMD4 的兩 種多克隆抗體（Abnova;#H00005710-AP11-1 ;PTG公司，#14899-1-AP)配伍，結果也存在明 顯非特異反應，標準品的濃度和吸光度數值沒有相關性。通過多次排列組合驗證發現，僅在 選用