快速磁分離電化學免疫傳感及檢測金黃色葡萄球菌的方法
【技術領域】
[0001]
本發明提供一種快速磁分離電化學免疫傳感及其對金黃色葡萄球菌高靈敏檢測方法，屬于生物傳感技術領域。
【背景技術】
[0002]金黃色葡萄球菌{Staphylococcus aureus)是一種廣泛存在于大自然的革蘭氏陽性球菌。金黃色葡萄球菌腸毒素{Staphylococcus aureus Enterotoxins，SES)是一種金黃色葡萄球菌分泌的細胞外毒素，能夠導致食物中毒，可引發胸部疼痛、嘔吐、腹瀉、中毒休克等癥狀，其半數致死劑量為0.02 Pg/kg。含有較高蛋白質含量的食物如乳及乳制品，常被檢測出有葡萄球菌腸毒素B (SEB)存在。SEB較穩定，經過高溫數分鐘加熱數分鐘后，仍有余留，應給予足夠重視。
[0003]目前檢測金黃色葡萄球菌的傳統方法:平板計數法、多管發酵法與濾膜法。這三種方法都具一些共同的缺點如:檢測步驟較為繁雜，檢測周期較長，勞動強度較大。為適應食品工業的需要，這幾年國內外發展出了幾種快速檢測金黃色葡萄球菌的方法如:小型生物化學測試、免疫學測試、基于核酸探針的方法、聚合酶鏈反應等。這些方法具有方便，快速等優點。但也存在一些缺點如:檢測費用較高，對自動化的儀器依賴度較高等。而近年來，在環境監控和食品安全領域，生物傳感器在病原體、有機物的檢測中扮演著越來越重要的角色。鑒于其高敏感度和專一性，免疫傳感已經被認為是最有效的檢測工具之一。
[0004]CdTe量子點一般較為穩定，溶于水，能接受激發光產生熒光。在交聯劑作用下，制備抗體功能化的量子點，可在抗體與量子點之間形成穩定的化學鍵，得到的連接產物結合牢固，較為穩定，可特異性檢測抗原。磁性納米球是納米尺度的磁性材料，除了具有一般納米粒子的光學和表面特性之外，磁性納米球還具有催化活性，良好的磁導向，生物相溶，生物降解等性質，可與許多生物分子結合，使其表面功能化。Fe3O4是用的最多的磁性納米球。Fe3O4粒子直徑小、毒性低、靈敏度高、性能穩定、原材料易得，此外其表面積較大，表面活性也較高。因此可選擇合適交聯劑將特定抗體結合到磁性納米球上，從而使磁性納米球帶有一定特殊功能。在交聯試劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥?自酰亞胺(NHS)作用下，功能化磁性納米球可與特定的抗原相結合，在外磁場作用力下，具有磁性的功能化生物分子可向磁場方向移動，從而集中在特定的部位。
[0005]免疫磁珠分離技術，是利用抗原(或抗體)包被的磁珠與抗體(或抗原)特異性結合，再外加磁場的作用下，可將樣品從復雜基質中分離出來，達到樣品富集濃縮的目的。免疫磁珠分離技術快速且特異性強，具備固相化試劑的優點，不需對待檢測細菌進行增菌，有助于降低原有檢測手段的檢測限。從而在食品、醫學等方面有其巨大的應用價值。
【發明內容】
[0006]發明的目的在于提供一種操作簡單，響應時間短，價格低廉，靈敏度高以檢測金黃色葡萄球菌的生物傳感器。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為:一種用于檢測金黃色葡萄球菌的電化學生物傳感器，包括輔助電極、參比電極和工作電極。其特征在于:首先分別合成了抗體功能化的磁性納米粒子(Fe3O4-Ab)和抗體功能化的量子點(QDs-Ab)。兩種功能化納米探針同時結合到金黃色葡萄球菌表面，并通過磁場作用迅速分離，結合電化學溶出伏安方法可實現食品中金黃色葡萄球菌快速檢測。
[0007]—種快速磁分離電化學免疫傳感及其對金黃色葡萄球菌高靈敏檢測，按照下述步驟進行:
(I) CdTe量子點的制備:
6 mM巰基丙酸(MPA)加入到2 mM CdCl2溶液中，用IM的NaOH溶液將PH調整到9.0，通入N2混合30min，再緩慢加入0.0625 M NaHTe溶液，形成暗黃色CdTe量子點。所獲得的量子點溶液回流10 h，可達粒徑為2.6 nm，濃度4.7 μΜ。將制成的量子點溶液通過4°C條件下15000g超濾10 min以除去過量的巰基丙酸，并反復潤洗兩次，最后用pH 7.4的PBS定容，并置于4 °(:的冰箱中保存。
[0008]其中步驟(I)中各反應物按照Cd2+/MPA/HTe物質量比為1:3:0.5添加。
[0009](2) CdTe量子點功能化:
取合成好的CdTe量子點溶液(4.7 μΜ),濃度為5 mg/ml的金黃色葡萄球菌抗體，以及交聯試劑1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)固體顆粒，混合室溫下攪拌I h，離心分離后，放置4°C的冰箱保存。
[0010]其中步驟(2)中CdTe量子點溶液/金黃色葡萄球菌抗體的體積比為15:1，金黃色葡萄球菌抗體/EDC/NHS的質量比為1:6:6。
[0011](3)磁性納米球功能化:
按照體積比為15:1取實驗室制備好的PBS緩沖溶液(pH 7.4)，濃度為5 mg /mL金黃色葡萄球菌抗體，Fe3O4固體粉末以及交聯劑1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，在室溫下混合反應I h，離心分離后放置4°C的冰箱保存。
[0012]其中步驟(3)中PBS緩沖溶液(pH 7.4) /金黃色葡萄球菌抗體的體積比為15:1，金黃色葡萄球菌抗體/Fe3O4固體粉末/ EDC的質量比為1:6:6。
[0013](4)工作電極預處理:
將裸電極依次用去離子水、無水乙醇和去離子水分別超聲10 min，再依次用粒徑為Iμπι、0.3 μπι、0.05 ym的氧化鋁粉末反復打磨至鏡面，然后分別置于乙醇、去離子水中超聲清洗10 min，最后用氮氣吹干備用。
[0014](5)工作電極的修飾以及傳感器的制備:
取37°C條件下培養，經梯度稀釋后的金黃色葡萄球菌，加入步驟(3)抗體功能化磁珠(Fe3O4-Ab)，室溫下加入轉子攪拌反應1min后，加入步驟(2)抗體功能化的量子點(QDs-Ab)，室溫下反應30 min。反應結束之后，取出轉子，在磁鐵上靜置吸附20 min。用移液槍小心取出上層清液，并加入試驗室自制HNO3 (0.1 M)，并超聲40 min。
[0015]其中金黃色葡萄球菌、Fe3O4-Ab、QDs-Ab以及HNO3各體積比為2:1:1:2.5，用PBS清洗電極表面后，將其浸入1~2 mL HAC/NaAC (pH 4.6)溶液中，轉子攪拌均勻。
[0016]上述的快速磁分離電化學免疫傳感及其對金黃色葡萄球菌高靈敏檢測，其特征在于:快速磁分離電化學免疫傳感器工作曲線的建立以及快速磁分離電化學免疫傳感器對實際牛奶樣品的檢測。所制備的快速磁分離電化學免疫傳感器工作曲線為:當金黃色葡萄球菌濃度為 2.21 XlO2 ~2.21 X 17 CFU mL 1 時，其線性方程為:y = 0.9934x - 0.3526，檢測限為:83 CFU mL ^所制備的快速磁分離電化學免疫傳感器其性能還包括良好的特異性，重復性和穩定性以及對實際牛奶樣品的檢測。
[0017]原理:本發明通過水相法成功制得CdTe量子點，隨后又分別對量子點以及磁性納米球進行功能化。功能化的量子點與磁性納米球能夠特異結合金黃色葡萄球菌，形成三明治結構的待檢測復合物。在試管底部外加磁場，此復合物在底部富集，通過除去上清液及適當洗滌，目標物可與雜質徹底分離，隨后再進行SWV電化學檢測。根據所得數據可獲得標準曲線和線性方程，間接測定待測樣品中金黃色葡萄球菌的濃度，如圖1、圖2和圖3所示。
[0018]與現有技術相比，本發明的優點在于:
(I)納米材料比表面積大，表面活性位點較多，生物親和性強，可用來做載體吸附或支撐免疫分子，有利于提高傳感器諸多性能。免疫納米磁珠和量子點主要通過免疫識別，對菌體進行捕獲，在磁場作用下快速分離，不破壞菌體生物學活性。另外抗原-抗體特異性結合決定了免疫傳感器的高靈敏度，特異性強，不受其他物質的干擾。磁分離以及電化學檢測過程也是快速、簡單。整個操作過程，簡便快速，實用性好，靈敏度高，為檢測食物中是否含有超標的金黃色葡萄球菌提供了另一種安全有效的新方法。
[0019](2)本實驗將納米技術與電化學免疫技術相結合，并通過快速磁分離，對牛奶中的金黃色葡萄球菌進行定量檢測，具有很好的特異性。相比于傳統的微生物學方法，該技術用于食品中金黃色葡萄球菌的檢測大大縮短了分析時間、操作簡單，能夠更好的滿足食品衛生、飲水安全、環境保護和控制傳染病等領域中快速檢測金黃色葡萄球菌的要求。
【附圖說明】
[0020]圖1快速磁分離電化學免疫傳感器的制備及其對金黃色葡萄球菌的檢測原理圖； 圖2檢測不同濃度金黃色葡萄球菌的SWV曲線圖(a) 0，(b) 2.2X 12, (c) 2.2X103，
(d) 2.2X 14, (e) 2.2X105，(f) 2.2X106，(g) 2.2X 17 CFU*mL S圖3不同濃度金黃色葡萄球菌SWV峰電流的標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0021]以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述，具體操作方法如下:
(I)CdTe量子點的制備
26 μ? 6 mM巰基丙酸(MPA)加入到50 mL 2 mM CdCl2溶液中，用IM的NaOH溶液將pH調整至IJ 9.0，通入N2混合30min，再緩慢加入0.8 mL 0.0625 M NaHTe溶液，形成暗黃色CdTe量子點。Cd2+/MPA/The物質量比為1:3:0.5。所獲得的量子點溶液回流10 h，可達粒徑為2.6 nm，濃度4.7 μΜ。將制成的量子點溶液通過4°C條件下15000g超濾10 min以除去過量