一種磁性血小板吸附顆粒及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬體外診斷試劑盒及新材料領域，具體涉及一種磁性血小板吸附顆粒及其 制備方法。
【背景技術】
[0002] 血小板是由骨髓中成熟的巨核細胞的細胞質脫落而成的，每個巨核細胞可產生 2000~7000個血小板。一個健康人每天生成血小板約1200億個。血小板平均的分布在血 液中，循環血液中的血小板一般處于靜止狀態，當血管破裂時會大量聚集。正常人血液中的 血小板濃度為1〇〇~300X 109/L。一般情況下血小板呈雙凸盤狀，受到刺激后會伸出足突， 不規則狀。直徑約2~4 y m，厚0? 2~1. 5 y m，平均體積7 y m3。血小板沒有細胞核，細胞 質呈淡藍色，并含有黃色的顆粒。
[0003] 血小板在激活狀態下降產生聚集反應，聚集（aggregation)指的是血小板彼此的 粘著，通常分兩個時相。第一聚集相也叫可逆聚集相；第二聚集相也叫不可逆聚集相。引起 血小板聚集的物質叫致聚劑，也叫誘導劑。病理性致聚劑包括病毒、細菌、免疫復合物、藥物 等。生理性致聚劑包括：二磷酸腺苷（ADP)、血栓燒A2 (Thromboxane A2)、膠原、凝血酶。
[0004] 而另一部分患者，尤其是一些冠脈PCI支架術后的患者，在使用阿司匹林+氯吡 格雷雙聯抗栓治療過程中發生出血事件，被迫中斷抗栓藥物治療、反復滴定合適的劑量，既 增加了患者痛苦，又進一步加劇了醫患關系的緊張。在上述背景下，呼吁個體化抗血小板 藥物的療效監測、個體化藥物治療調整的呼聲日漸高漲，而其中的涉及的核心技術血小板 功能檢測儀，已經歷60余年的發展，深究其工作原理無外乎以下四大類：1、光電比濁法：主 要包括經典的透光率集合度測定（LTA)法、VeiifyNo熱# (Accumetrics，美國），前身為U1 tegra快速血小板功能分析儀（Ultegra RPFA)檢測法等，使用光線穿過檢測池，觀察血小 板聚集過程中透光度由弱變強從而產生的光電流變化的曲線來測量血小板在各種促聚劑 引發下的聚集程度。2、血球計數法：主要包括美您、以及近期中國江蘇英諾 華公司在此基礎上學習、改良的血小板功能檢測儀（863項目）CN201210006575、 CN201110425560、CN201220009703、CN201120531520、CN201220009721、CN201110425556、 CN201210006781，通過血球儀連續測量血小板在各種促聚劑引發下，血小板計數值由高到 低的變化曲線來推算血小板的聚集情況。3、黏度計檢測法將原先用于工業用途的粘度計改 良后應用于凝血監測領域。主要包括第一代微孔粘度計一一PFA-100 (Siemens，德國），以及 后續的旋轉運動粘度計--血栓彈力圖分析儀（Thrombelastography，Hemonetics，美國）、 ('西芬斯辦CFMS血栓彈力圖儀，中國北京2012)和線型運動粘度計一一Sonoclot凝血與血 小板功能分析儀（Sienco,美國）。通過觀察血小板聚集、凝血過程中血液凝塊的粘度、彈性 等物理性狀的改變來推算血小板功能。4、電阻抗檢測法多見于專利文獻中，觀察在凝血過 程中血小板聚集導致的血液電阻抗變化繼而推算出血小板功能，目前尚未見臨床實際應用 的的商品化廣品。
[0005] 目前國際主流的檢測方法為Accumetrics公司的VeHfyNow#檢測技術，如圖1所 示，為Accumetrics公司的％rifyNow?.血小板功能檢測試劑盒的結構，圖2為Accumetrics 公司的血小板功能檢測試劑盒中的血小板吸附顆粒示意圖，其專利保護群中 的美國專利8, 574, 828、7, 790, 362、5, 922, 551陳述了一種使用P2Y12受體拮抗劑（代表藥 物為噻氯吡啶、氯吡格雷等噻吩并吡啶類化合物）療效檢測的方法，其主要特征在于使用 "包裹GPIIb/IIIa受體的配體的聚苯乙烯或乳膠顆粒"的試劑，其含有"紅外吸收染料"，在 800nm附近的紅外波段通過光電比濁法檢測P2Y12受體拮抗劑療效的方法和裝置。之所以 要使用"紅外吸收染料"是因為US 5, 922, 551所提到的該產品早期使用了商品化的藍色珠 子，在光源下發現其在氧合程度不同的全血樣本中，由于氧合血紅蛋白〇2Hb/脫氧血紅蛋白 tHb消光度的不同導致測量值產生了較大的不確定度，因此自行制備了一種加有紅外吸收 染料的珠子。美國專利7, 833, 793、8, 043, 826陳述了僅需要1滴血就通過熒光素/熒光素 酶檢測ATP的消耗數量來實現阿司匹林療效的方法和裝置。
[0006] 美國專利7, 595, 169陳述了一種確定血小板聚集百分比法，應該指出的這份專利 的內容極為簡單，僅僅是一個概念的名詞解釋，就如同注射用頭孢曲松藥品說明書，藥學， 檢驗醫學教科書這樣的公開資料中所述的"某種藥物的血漿蛋白結合率"其計算方法為 (被血漿蛋白吸附的藥物八被血漿蛋白吸附的藥物+游離藥物）*1〇〇% )以及醫學檢測領 域類似的游離膽紅素/總膽紅素，游離三碘甲狀腺素/三碘甲狀腺素一般，所以這是從事該 領域的一般工程技術人員所能想到的常識性概念。
[0007] 美國專利7, 205, 115陳述了一種花生四烯酸在血小板功能測定法的反應試劑的 細節，詳細陳述了的反應試劑的PH、粒徑大小、反應物體積等細節，并劃設了一個過于寬泛 的保護范圍，其核心內容使用"一種抗氧化劑保護花生四烯酸"的方法在其實在食品、藥品 中早已得到廣泛共識并付諸于生產實踐、產品營銷宣傳。美國專利7, 205, 115所述的花生 四烯酸是一種常見的食物成分，主要存在于花生油中，并最終被我國列入食品添加劑《GB 26401-2011花生四烯酸油脂》。而保護花生四烯酸的物質，諸如魚肝油中的EPA(二十碳五 烯酸）和DHA (二十二碳六烯酸，俗稱腦黃金），其能夠抑制花生四烯酸轉變為內過氧化物， 這在上世紀90年代中國史玉柱的巨人集團腦黃金產品的市場營銷宣傳（公共廣播、電視、 報紙）中早已進入公共知識領域。類似的使用生育酚（主要成分維生素E)加入花生油以 防止油脂在烹調過程中過快氧化的做法早已通過魯花、金龍魚、福臨門等油脂公司市場營 銷宣傳也早已為公眾所知。因此美國專利7, 205, 115中的"一種抗氧化劑保護花生四烯酸" 也同樣是一個從事該領域的一般工程技術人員所能想到的通用技術手段。
[0008] 美國專利7, 179, 652、6, 613, 573的檢測方法，是基于血栓彈力圖（TEG. RTM)的技 術，并沒有使用光電比濁法。
[0009] 隨著中國國內抗血小板藥物（代表藥物阿司匹林、氯吡格雷）個體化治療需求的 日益增長，目前臨床主要使用的血栓彈力圖（TEG)技術由于其檢測費用高（約400元/次） 測定時間長（10-30分鐘）、不能進行批量分析、(血小板圖）專利技術 的復雜性，導致其檢測報告數據紛繁，甚至三甲醫院的高年資醫生、護士都難以讀懂檢測報 告，上述缺點使其難以在基層醫療機構開展。另一方面，目前國際公認上抗血小板藥物檢測 的主要方法主要是VerifylSkm#光電比濁法，其在國內剛剛取得批準文號上市，試劑盒價格 非常昂貴，因此盡早開發一種具有我國自主知識產權的血小板吸附顆粒作為體外診斷試劑 的核心材料，并繼而研制相應的光比濁法血小板功能檢測裝置，其性能期望與 相當，但結構有所改進的體外診斷試劑檢測裝置，使其為患者提供更優的個體化醫療服務， 提高國內在該先進醫療器械制造領域的技術水平。
[0010] 為實現上述目標，本發明擬采用殼聚糖磁性微球包衣工藝來實現，所述的殼聚糖 磁性微球：以殼聚糖與磁性顆粒為原料制成的球形有機-無機物復合材料，近二十年來國 內外已有多篇文獻報道了其制作工藝，檢索文獻列表：
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