一種基于sers技術檢測血清中特異性抗原的微流裝置的制造方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于光譜學和生物分析領域，具體涉及一種基于表面增強拉曼散射技術檢測血清中特異性抗原的微流裝置的設計及應用。
【背景技術】
[0002]隨著環境問題的日益嚴重，我們所處在一個極易被病毒感染的環境中。非典、流感、MERS等病毒讓人人自危，大部分病毒都是存在于血液當中，如何檢測血清中的某種病毒含量的方法在早期診斷和曝光后治療診斷有著重要作用。已知利用抗原抗體反應用于測量血清病毒細胞的檢測手段有免疫熒光顯微鏡法、酶聯免疫測定法和聚合酶鏈式反應檢測，但存在一定缺陷。免疫熒光顯微鏡成本高，用于定量測試有一定困難，且技術程序較復雜。酶聯免疫測定法較難尋找合適的酶催化底物，使其在應用上有一定困難，而且顯示對比存在較大的誤差。聚合酶鏈式反應檢測技術手段困難，對儀器設備要求過高，操作繁瑣，價格昂貴。這些缺點限制了這些手段的應用，只能用于實驗室檢測。
[0003]表面增強拉曼散射(簡稱為SERS)是指在粗糙的金屬(如金、銀、銅)的表面或溶膠體系中，由于樣品表面或近表面的電磁場的增強導致分子的拉曼散射信號較普通拉曼散射信號大大增強的現象。近年來，SERS已經成為一種成熟的分子振動光譜技術，廣泛應用于化學、材料和生命科學等領域。SERS所得到的拉曼光譜信號強度比常規拉曼光譜信號強度高出16以上的數量級，為痕量物質檢測開拓了一個新的技術方向。微流體技術是指流體在微米級別的通道中對其操控的技術，通過對微流體系統所需的器件包括栗、閥、混合器、過濾器等的加工，將裝置加工成一塊芯片大小。微流控裝置具有液體流動可控、消耗試樣和試劑極少、分析速度成十倍上百倍地提高等特點。近年來微流體技術的快速發展，已經在化學、醫藥及生命科學等領域上造成革命性的沖擊。利用微流技術與SERS技術手段聯用，可以在生物分子檢測和痕量樣品檢測應用上開啟一個新的方向。
【發明內容】
[0004]為了解決上述問題，本發明提出一種基于SERS技術檢測血清中特異性抗原的微流裝置。該裝置通過對人體血清中某些病毒細菌的特異性抗原含量的測定，可以判斷人體血清中這些病毒細菌的含量是否超過人體健康標準。待測試人體血清樣本、結合了特異性抗體的免疫磁珠溶液、結合待測血清抗原的核殼結構金納米粒子溶液分別通過其對應的微流通道入口注入到微流裝置中，通過安裝在入口處的微流栗控制微流通道中的流速。在微流裝置中，血清中的病毒抗原和金納米顆粒攜帶的抗原與磁珠攜帶的抗體發生免疫復合反應，生成的免疫復合物鍵合在磁珠上。在微流裝置末端，通過控制SERS檢測單元上的通電螺線管來吸附鍵合了特異性抗原抗體復合物的磁珠，聚合物吸附在離SERS檢測單元最近的微流通道處。對磁珠攜帶的免疫復合物進行拉曼光譜測試，并對光譜數據進行化學計量學分析，最終得到血清中待測抗原的濃度。
[0005]本發明所采用的技術方案是:一種基于SERS技術檢測人體血清中特異性抗原的微流裝置，主要由待測血清樣品通道入口(I)、結合了特異性抗體的免疫磁珠通道入口
(2)、結合了待測血清抗原的核殼結構金納米粒子通道入口(3)、微流裝置通道出口(4)、SERS檢測單元(5)、傳感控制器(6)組成。該微流裝置為三明治結構，最下層為基底層，中間層為微流通道層，上層為封裝層。每個微流通道入口與相應的微流導管相連；待測血清樣品通道口(I)、免疫磁珠通道口(2)、金納米粒子通道口(3)處安裝了控制通道中流速的微流栗。微流通道采用螺線管形狀設計。在微流裝置底部，分布著SERS檢測單元(5)和微流裝置傳感控制器(6)，二者均貼片放置在封裝層上。
[0006]進一步地，在本發明中，該微流通道底層和封裝層為使用石英層或聚乙烯構成的透明結構；微流通道層使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料加工形成方形通道，所有通道為200-250 μm 寬、80-100 μm 高。
[0007]進一步地，在本發明中，SERS檢測單元包含一個可控制開關的通電螺線管，通過開關來控制SERS檢測單元對免疫復合物的聚集。
[0008]進一步地，在本發明中，傳感控制器包含中心控制芯片、顯示流速的LED顯示屏、微流栗組成，傳感控制器通過控制微流栗的轉速使得微流通道入口處三種液體流速一致，達到最佳免疫反應條件。
[0009]—種基于SERS技術檢測血清中特異性抗原的微流裝置，使用方法包括以下步驟:
[0010]I)微流裝置制備:以石英玻璃為底層，在上面涂抹一層光刻膠，用軟光刻技術在光刻膠上刻出微流通道形狀，使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)處理生成微流通道層，加熱固化底層和中間層，所有微流通道為200-250 μm寬、80-100 μm高，通過熱壓法對微流通道層和相應的最上層進行封裝，在微流裝置封裝層上貼片放置SERS檢測單元和傳感控制器；
[0011]2)制備結合了待測抗原的核殼結構的金納米粒子:通過氯金酸鹽和檸檬酸鈉水溶液法得到粒徑為50nm左右的金納米粒子，然后得到金膠體納米粒子與正硅酸乙酯(TEOS)和氨水反應，生成具有金核二氧化硅殼的納米粒子，二氧化硅殼厚度約為2nm ;使用物理或化學方式對納米粒子處理，使其表面修飾待測血清中的抗原；
[0012]3)制備結合了特定抗體的免疫磁珠:I μ m大小磁珠通過購買獲得，對磁珠進行生物保護處理，在其表面包裹一層生物免疫膜，如鏈霉親和素，用生物方法使特定抗體修飾在磁珠表面，制備磁珠保存在生理溶液中；
[0013]4)打開傳感控制器開關，分別在各個微流通道入口通入相對應的微流液，微流液在微流通道內流動I分鐘后調控傳感控制來控制好微流液流速，打開SERS檢測單元開關，當離SERS檢測單元最近的微流通道內聚集大量黑色磁性復合物，關閉傳感控制器停止微流液的流動；將微流裝置置于拉曼光譜儀的樣品池中，對聚集的復合物進行不同位置的信號測試；
[0014]5)數據處理，得到結果:通過得到的SERS光譜數據進行化學計量學分析，得到該檢測特異性抗原的濃度。
[0015]本發明的有益效果如下:
[0016]I)本發明設計的一種基于SERS技術檢測血清中特異性抗原的微流裝置，整個裝置大小約為一個火柴盒大小，便于測試和攜帶，可直接置于拉曼樣品池中檢測。通過在待測區域對免疫復合物進行SERS光譜測試，可以獲得高重復高特異性的SERS信號，為生物分子檢測開拓了一個新思路。
[0017]2)通過SERS技術與微流技術聯用，用于檢測血清中特異性抗原，利用本裝置檢測，具有檢測耗時少，檢測樣品少，結果準確，靈敏度高，微流裝置可重復利用的特點。
【附圖說明】
[0018]圖1為一種基于SERS技術檢測血清中特異性抗原的微流裝置的平面結構圖；
[0019]圖2為一種基于SERS技術檢測血清中特異性抗原的微流裝置的3維圖；
[0020]圖3為一種基于SERS技術檢測血清中特異性抗原的微流裝置檢測抗原流程圖；
[0021]圖4為待測抗原、免疫磁珠、金納米粒子發生特異性抗原抗體反應過程；
[0022]圖1中，I為待測血清樣品通道入口 ；2為結合了特定抗體的免疫磁珠通道入口 ；3為結合了待測抗原的核殼結構金納米粒子通道入口 ；4為微流通道出口 ；5為SERS檢測單元；6為傳感控制器；61、62、63為傳感控制器內的微流栗。
【具體實施方式】
[0023]下面結合微流裝置圖對本發明結構原理和工作原理作更進一步的說明。
[0024]如圖1和圖2，一種基于SERS技術檢測血清中特異性抗原的微流裝置，主要由待測血清樣品通道口 1、與特定抗體結合的免疫磁珠通道口 2、與檢測抗原結合的核殼結構金納米粒子通道口 3、微流通道出口 4、SERS檢測單元5，傳感控制器6組成。
[0025]圖3為一種基于SERS技術檢測血清中特異性抗原的微流裝置檢測抗原流程圖，首先打開傳感控制器開關，各微流通道入口流入相對應的微流液，傳感控制器控制好各微流通道入口微流液的流速，微流液在微流通道內流動I分鐘后，打開SERS檢測單元開關，發現離SERS檢測單元最近的微流通道內聚集了一層黑色的免疫復合物，當免疫復合物肉眼觀察不在增多時，關閉傳感控制器停止微流液的流動；將微流裝置置于拉曼光譜儀的樣品池中，對聚集的復合物進行不同位置的信號測試，通過對SERS光譜數據進行化學計量學分析，得出待測血清中特異性抗原的濃度。
[0026]傳感控制器6通過微流栗61、62、63來控制好各微流通道內微流液速度，檢測樣品血清通過I通道入口進入微流裝置，結合了特定抗體免疫磁珠通過2通道入口進入微流裝置，使得二者混合一段時間，初步發生抗原抗體特異性結合反應，待測血清中的特異性抗原吸附在免疫磁珠上。反應一定程度的免疫磁珠和與結合了待測血清抗原的核殼結構金納米粒子進一步免疫復合反應，三者反應形成一個聚集在一起的磁性免疫復合物，免疫復合反應如圖4所示。當微流液流經微流裝置底部，微流液中的磁性免疫復合物由SERS檢測單元5分離，通過磁性吸附作用，使磁性免疫復合物聚集在離SERS檢測單元最近