一種流感亞單位疫苗單價原液血凝素含量的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種流感亞單位疫苗單價原液血凝素含量的 檢測方法，用于快速檢測流感亞單位疫苗單價原液中血凝素的含量。
【背景技術】
[0002] 流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道疾病。其通過呼吸道傳播，具有相對 高的感染率，可造成大規模流行的人、禽畜共患的急性呼吸道傳播疾病，并且其中的一些可 以導致嚴重的發病率和致死率，給社會帶來巨大的損失。據統計，全球每年約有5%~15% 的人口感染流感病毒，并導致300萬~500萬的嚴重病例和50萬的死亡病例。最大規模的 流感大流行發生于1918~1919年，造成2100~4000萬人死亡，超過第一次世界大戰的戰 爭死亡人數。到2010年3月30日為止WHO報道了 492例禽流感病例，并且有291例死亡， 各國的公共衛生部門進行了努力來預防該危險，并且WHO建立了全球監控網絡，并且希望 能夠根據該監控來進行預警。流行性感冒病毒分甲、乙、丙三型。其中，甲型致病力最強，可 感染動物和人類并引起流行甚至是世界范圍內的大流行；乙型致病力稍弱，可引起局部流 行。流感病毒經常發生抗原漂移和抗原轉移，逃避機體免疫系統的防御，這也是造成大流行 的原因。到現在為止，控制感染性疾病傳播的最有效方法是疫苗。尤其對于流感病毒來說， 流感疫苗接種是預防和控制流感病毒傳播的最有效的手段。
[0003] 疫苗的應用使流感病毒傳染得到了有效的控制，有效地降低了了這些傳染病的發 病率和死亡率。疫苗中主要有效成分為血凝素，流感病毒血凝素（HA)蛋白是一種保護性抗 原，相對分子量為61000,由HA1 (相對分子量約37000)和HA2 (相對分子量約為25000)兩 個亞基以二硫鍵連接，其通過誘導中和抗體（nAb)來保護宿主。因此，流感疫苗的質量是對 血凝素的含量來進行評價的，并且疫苗的效果是通過血凝素抑制抗體的滴度來評價的。當 前血凝素含量測定的標準方法為單向免疫擴散法，具體步驟如下：
[0004] 將抗原參考品稀釋至控制濃度，然后以9 : 1的比例分別將抗原參考品和樣品裂 解劑混勻，室溫靜置30分鐘。抗原參考品再進行100%、75%、50%、25%稀釋，樣品稀釋至 抗原參考品范圍內，取對應型別的抗體加入1%瓊脂中制板，打孔，置濕盒20~25°C孵育 18~24小時。用PBS浸泡1小時后，干燥、染色、脫色。準確測量抗原參考品和供試品形成 的沉淀環的直徑，以抗原參考品形成的沉淀環的直徑對其相應抗原濃度作直線回歸，求得 直線回歸方程，代入供試品的沉淀環直徑，即可得到供試品的血凝素含量。
[0005] 在疫苗的生產中發現，疫苗的檢測速度制約了生產周期，檢測結果支持下一步工 作的進行，僅僅單向免疫擴散試驗周期至少需要24小時，需要耽擱一天生產進度。同時， 在流感亞單位疫苗生產中，作為內控檢測我們需要對單價原液樣品的檢測包含以下2項： "SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測供試品純度試驗"和"總蛋白含量測定試驗"我們發現將 現有試驗所得數據綜合分析即可得知血凝素在樣品中的含量，且試驗速度快，周期短，檢測 時間不超過3小時，所得結果可以作為單向免疫擴散法的補充與預判斷，指導下一步生產 工作。
【發明內容】
[0006] 針對上述存在的問題，本發明的目的在于，提供了一種流感亞單位疫苗單價原液 血凝素含量的檢測方法，所述檢測方法能能夠快速檢測流感亞單位疫苗單價原液中血凝素 的含量。
[0007] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0008] -種流感亞單位疫苗單價原液血凝素含量的快速檢測方法，所述檢測方法包括以 下步驟：
[0009] (1)總蛋白含量測定；
[0010] ⑵SDS-PAGE電泳及電泳圖分析；
[0011] (3)血凝素含量換算：
[0012] 血凝素HA含量=總蛋白含量X (HA1百分比+HA2百分比）。
[0013] 進一步的，步驟（1)所述的總蛋白含量測定方法為Lowry法、BCA法或考馬斯亮藍 法。
[0014] 優選的，所述總蛋白含量測定方法為Lowry法，具體步驟包括：
[0015] 1)蛋白標準曲線繪制：
[0016]量取 100 y g/ml 的標準蛋白溶液 0? 0ml、0. 2ml、0. 4ml、0. 6ml、0. 8ml、l. 0ml，分別 置于試管中加水至1. 〇ml，分別再向上述試管中依次加入5. 0ml堿性銅溶液，漩渦振蕩器混 勻，室溫放置10分鐘。分別再向上述試管中依次快速加入酚試劑0. 5ml，漩渦振蕩器混勻， 室溫放置30分鐘；
[0017] 紫外可見分光光度計檢測波長650nm處的吸光度值0D65。，按照標準管蛋白的濃度 及其對應的〇D65。繪制標準曲線；以標準曲線的蛋白濃度及其對應的0D65。，使用計算機計算 出直線回歸方程以及相關系數；
[0018] 2)樣品測定：
[0019] 量取一定體積供試品置于試管內，其中含蛋白質30~60 yg，再加水至總體積為 1.0ml;或將樣品稀釋至蛋白含量約50 μg/ml，取lml置于試管內；別再向上述試管中加入 堿性銅溶液5. 0ml，漩渦振蕩器混勻，室溫放置10分鐘；依次再向每支試管快速加入酚試劑 0. 5ml，漩渦振蕩器混勻，室溫放置30分鐘；顯色后，如發現渾濁，可以經每分鐘3000轉離心 15分鐘后，取上清液進行測定；在波長650nm處測定吸光度00 65。;將所測得的供試品的0D 65。 帶入直線回歸方程，計算出供試品的總蛋白質含量。
[0020] 進一步的，步驟（2)所述的SDS-PAGE電泳為還原型SDS-PAGE電泳，其具體步驟包 括：
[0021] 1)配膠：
[0022] 配制聚丙烯酰胺凝膠，下層10~15%分離膠，上層5%濃縮膠；
[0023] 2)上樣：
[0024] 根據步驟（1)中總蛋白含量測定進行的檢測結果稀釋樣品，樣品加入還原型上樣 緩沖液，充分混勻后，煮沸5分鐘后上樣，樣品蛋白含量為5~10 y g/孔；
[0025] 3)電泳：
[0026] 將制備好的凝膠放入電泳槽中，加入Tris-甘氨酸電極緩沖液，淹沒內槽和至少 三分之一的外槽，然后用進樣器將上述處理好的樣品和Marker加入到SDS-聚丙烯酰胺凝 膠（SDS-PAGE)的樣品孔中；凝膠所加電壓為60伏，當溴酚藍染料前沿進入分離膠后，將電 壓提高到100~140伏，室溫總電泳時間為1~2小時，電泳結束后小心從玻璃板中取出凝 膠，做標記；
[0027] 4)凝膠固定和染色：
[0028] 將凝膠用純化水漂洗3次以后，放入適量蛋白電泳凝膠固定液中，置于水平搖床 緩慢搖動約20分鐘，將凝膠取出用純化水漂洗3次，置于蛋白電泳凝膠染色液中，確保染色 液可以充分覆蓋凝膠，置于水平搖床緩慢搖動，染色2小時或者過夜；
[0029] 5)凝膠脫色：
[0030] 加入適量蛋白電泳凝膠脫色液，確保脫色液可以充分覆蓋凝膠，置于水平搖床緩 慢搖動，室溫脫色，期間至少更換脫色液2~3次，直至藍色背景基本上全部被脫去，并且蛋 白條帶染色效果達到預期。
[0031] 進一步的，步驟（2)中所述的電泳圖分析指凝膠脫色完畢后用凝膠成像分析儀拍 照，使用凝膠圖譜分析軟件對亞單位流感疫苗單價原液圖片進行圖片導入、數據分析，測定 其中HA1、HA2條帶在總蛋白中的含量百分比。
[0032] 本發明相比現有技術的有益效果是：
[0033] 1、本發明所述的流感亞單位疫苗單價原液血凝素含量的快速檢測方法，檢測試驗 簡單，能夠快速檢測出血凝素蛋白在樣品中的含量，可以作為單向免疫擴散法的補充與預 判斷，指導下一步生產工作。
[0034] 下面結合實施例，對本發明作進一步說明。
【附圖說明】
[0035] 圖1-圖3為實施例2-4中SDS-PAGE電泳圖。
【具體實施方式】
[0036] 實施例1
[0037] -種流感亞單位疫苗單價原液血凝素含量的快速檢測方法，所述檢測方法包括以 下步驟：
[0038] (1)總蛋白含量測定；
[0039] (2) SDS-PAGE電泳及電泳圖分析；
[0040] (3)血凝素含量換算：
[0041] 血凝素HA含量=總蛋白含量X (HA1百分比+HA2百分比）。
[0042] 進一步的，步驟（1)所述的總蛋白含量測定方法為Lowry法、BCA法或考馬斯亮藍 法。
[0043] 優選的，所述總蛋白含量測定方法為Lowry法，具體步驟包括：
[0044] 1)蛋白標準曲線繪制：
[0045] 量取 100 y g/ml 的標準蛋白溶液 0? 0ml、0. 2ml、0. 4ml、0. 6ml、0. 8ml、1. 0ml，分別 置于試管中加水至1. 〇ml，分別再向上述試管中依次加入5. 0ml堿性銅溶液，漩渦振蕩器混 勻，室溫放置10分鐘。分別再向上述試管中依次快速加入酚試劑0. 5ml，漩渦振蕩器混勻， 室溫放置30分鐘；
[0046] 紫外可見分光光度計檢測波長650nm處的吸光度值0D65。，按照標準管蛋白的濃度 及其對應的〇D 65。繪制標準曲線；以標準曲線的蛋白濃度及其對應的0D 65。，使用計算機計算 出直線回歸方程以及相關系數；
[0047] 2)樣品測定：