葡萄串樣納米粒子、免疫探針、其制備方法及應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明屬于免疫分析技術領域，具體涉及一種葡萄串樣納米顆粒(GCNPs)-酶-免疫探針的制備方法及應用。
【背景技術】
[0002]酶聯免疫分析技術是一種非常成熟的固相免疫分析模式，在臨床診斷分析中已經獲得了多年的應用，同時，近十年來，也在環境監測、食品安全危害物檢測等領域中獲得了廣泛的應用。臨床診斷和食品安全檢測領域所面臨的重要問題是低濃度抗原的免疫檢測，以及其檢測的準確性和可靠性。提高免疫檢測靈敏度的方法之一就是制備高靈敏的免疫探針。
[0003]貴金屬納米材料是一種重要的納米材料，不僅具有納米材料的宏觀特征，同時其自身的物理化學性質也與納米材料的性能有機結合了起來，具有粒徑均一，分散性好，比表面積大等特性，因此可用于納米免疫探針的制備。
[0004]目前，在環境監測、食品危害物分析等許多領域，都對更高靈敏度的免疫分析方法具有迫切的需求，因此，提高傳統的酶聯免疫分析方法的檢測性能，具有重要的應用價值。許多研究采用新的檢測模式，如化學發光、電化學發光，與傳統酶聯免疫分析方法相比，它們具有更靈敏的檢測能力，但是這些免疫分析方法需要較昂貴的設備和試劑，因此，檢測成本顯著提高，這極大地阻礙了其在環境監測、食品危害物分析等許多領域的應用。
【發明內容】
[0005]針對現有技術的不足，本發明的目的之一在于提供一種葡萄串樣納米粒子(GCNPs)及其制備方法。
[0006]本發明的目的之二在于提供所述葡萄串樣納米粒子的用途，例如，其在制備免疫探針中的用途。
[0007]本發明的目的之三在于提供一種基于所述葡萄串樣納米粒子的免疫探針(葡萄串樣納米-酶-免疫探針，或稱GCNPs-酶-免疫探針，或者信號放大GCNPs-酶-免疫探針，簡稱免疫探針)及其制備方法。
[0008]本發明的目的之四在于提供所述免疫探針在酶聯免疫檢測中的應用，例如，基于所述免疫探針的酶聯免疫檢測方法。
[0009]為實現前述發明目的，本發明采用的技術方案包括:
[0010]—種葡萄串樣納米粒子(GCNPs)的制備方法，其包括:以蛋白修飾的納米銀三角片作為模板，并以氯金酸作為氧化劑，通過伽凡尼取代反應制備葡萄串樣納米粒子。
[0011 ] 所述GCNPs具有比表面積大、分散性良好等特性。
[0012]其中，所述納米銀三角可以采用常規方法制備，例如可參考Zhang，Q.;Li，N.;Goebl, J.；Lu, Z.；Yin, Y.J.Am.Chem.Soc.2011，133，18931-18939 等文獻制備。
[0013]在一較佳實施方案之中，所述的葡萄串樣納米粒子的制備方法包括:
[0014](I)將牛血清蛋白加入尺寸為15nm?30nm的納米銀三角的溶液中混合均勾，使形成的混合溶液中牛血清蛋白的濃度為0.01mg/mL?5mg/mL，且牛血清蛋白與納米銀三角的摩爾比為5:1?20:1，并靜置過夜；
[0015](2)向步驟⑴所獲混合反應溶液中加入抗壞血酸，使形成的混合物中抗壞血酸的濃度為0.08mM?5mM之后以0.1mT,/miη?2mT,/miη的速度注入濃度為0.0lmM?0.5mM的HAuCl4溶液，獲得葡萄串樣納米粒子。
[0016]由前述方法制備的葡萄串樣納米粒子，其粒徑為20nm?50nm。
[0017]一種免疫探針，其包含所述的葡萄串樣納米粒子，所述葡萄串樣納米粒子上修飾有辣根過氧化物酶標記的抗體(IgG-HRP)。
[0018]其中，IgG-HRP是吸附在GCNPs表面。
[0019]—種免疫探針的制備方法，其包括:將所述的葡萄串樣納米粒子分散于含有0.1mM?1mM碳酸鉀或碳酸鈉的0.01?0.2mg/mL辣根過氧化物酶標記的抗體溶液中，0°C?8°C震蕩Ih?5h，之后于8000rpm?1000rpm離心1min?20min，進而于沉淀中獲得所述免疫探針。
[0020]進一步的，所述的免疫探針的制備方法還可包括:將離心獲得的沉淀以含有0.01mg/mL?0.lmg/mL辣根過氧化物酶的溶液重懸，備用。
[0021]所述IgG-HRP是針對不同檢測物的一個結構域、或者有效基團的辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體，或多克隆抗體。
[0022]在一典型實施案例中，所述免疫探針的制備方法可以包括:將0.5-2mLGCNPs復合材料8000rpm離心lOmin，用含有0.0OlM碳酸鉀的0.01-0.2mg/mLIgG-HRP (辣根過氧化物酶標記的抗體)溶液重懸，4°C震蕩3h，9000rpm離心15min，用0.5_lmL含有0.01-0.1mg/mL辣根過氧化物酶的酶標稀釋液重懸。
[0023]在一更為具體的實施案例之中，所述免疫探針的制備方法包括以下具體步驟:
[0024]1.利用基于蛋白修飾的納米銀三角片為模板，氯金酸為氧化劑，通過伽凡尼取代反應制備GCNPs:
[0025]a.將200 μ L牛血清蛋白溶液(10mg/mL)加入到40mL納米銀三角(0.1 μ Μ)溶液中，混合均勻，靜置過夜。
[0026]b.取5-10mL上述混合溶液，加入825 μ L，0.01-0.6Μ抗壞血酸(AA)，再將5_20mL，0.08mM的HAuCl4W lmL/min的速度注射入，得到GCNPs ；
[0027]I1.GCNPs-酶-免疫探針的制備
[0028]a.將0.5-2mL步驟Ib所獲的GCNPs8000rpm離心lOmin，用含有0.0OlM碳酸鉀的 0.01-0.2mg/mLIgG-HRP 溶液重懸，4 °C 震蕩 3h，9000rpm 離心 15min，用 0.5-lmL 含有0.01-0.lmg/mL辣根過氧化物酶的酶標稀釋液重懸，即得到信號放大GCNPs-酶-免疫探針。
[0029]本發明中由于GCNPs具有極高的比表面積，單個納米材料可以同時負載多個酶標記抗體分子，進而極大提高免疫探針中酶與抗體的比例，因此，使用該免疫探針進行免疫分析，特別是對微量的待分析物進行免疫檢測時，可放大免疫檢測的信號，提高檢測靈敏度。
[0030]所述的免疫探針在酶聯免疫檢測中的應用。
[0031 ] 一種酶聯免疫檢測方法，其包括:
[0032]將所述的免疫探針與一系列不同濃度的目標抗原標準樣品在適于使免疫探針中所含抗體與所述抗原特異性結合的液相環境中進行酶聯免疫反應，并記錄檢測型號，由此建立免疫探針檢測信號與抗原濃度之間的標準對應關系；
[0033]以及，將所述免疫探針與含有未知濃度的目標抗原的待測樣品在適于使免疫探針中所含抗體與所述抗原特異性結合的液相環境中進行酶聯免疫反應，并依據檢測型號及所述標準對應關系而確定待測樣品中的目標抗原濃度。
[0034]—種基于所述免疫探針的間接競爭酶聯免疫分析方法，包括以下步驟:
[0035]a.將作為包被抗原的小分子半抗原與卵清蛋白或牛血清蛋白的偶聯物溶于碳酸鹽緩沖液而形成包被液，25°C?37°C孵育I?4h，再以磷酸鹽緩沖液洗滌后，加入以作為封閉液的、濃度為0.001wt%的分子量為2000?10000的聚乙二醇溶液于0°C?8°C封閉過夜；
[0036]b.將步驟a所獲的包被抗原溶液與一系列不同濃度的小分子標準品的磷酸鹽緩沖液溶液混合，再加入含小分子抗體的酶標稀釋液，25°C?37°C孵育后，以磷酸鹽緩沖液洗滌，所述酶標稀釋液采用包含0.1wt %明膠和0.05v/v%吐溫-20的pH值為7.0?8.0、濃度為0.0lM?0.05M的磷酸鹽緩沖液；
[0037]c.向步驟b所獲的各競爭反應混合體系中加入含有所述免疫探針的抗體稀釋液，所述抗體稀釋液采用包含0.1wt %明膠和0.05v/v%吐溫-20的pH值為7.0?8.0、濃度為0.0lM?0.05M的磷酸鹽緩沖液，25°C?37°C孵育0.5h?2h后，以磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0038]d.向步驟c所獲的各混合反應體系中分別加入顯色液，25°C?37°C顯色1min?30min，再加入作為終止液的、濃度為2M?4M的硫酸溶液，之后測量各混合反應體系于波長為450nm?650nm時的吸光值A，建立A與抗原量的標準對應關系。
[0039]在一更為具體的實施方案之中，所述間接競爭酶聯免疫分析方法包括以下步驟:
[0040]a.以小分子半抗原與卵清蛋白或牛血清蛋白的偶聯物作為包被抗原，并以濃度為0.01-0.1M、pH值為9-10的碳酸鹽緩沖液按1:2000?1:16000的體積比進行稀釋后作為包被液加入酶標板的不同孔中，25-37°C孵育l_4h，PBST洗滌液洗滌3_5次，然后加入作為封閉液的、濃度為0.0Olwt-%的分子量為2000-10000的聚乙二醇溶液，0_8°C封閉過夜；
[0041]b.在前述酶標板的不同孔中再分別加入含有一系列不同濃度的小分子標準品的磷酸鹽緩沖液溶液，再加入含小分子抗體的酶標稀釋液，25-37°C孵育0.5-2h后以PBST洗滌液洗滌3?5次，所述酶標稀釋液采用包含0.1wt%明膠和0.05% (v/v)吐溫-20的pH值為7.0-8.0、濃度為0.01-0.05M的磷酸鹽緩沖液；
[0042]c.在前述酶標板的不同孔中再分別加入含有所述免疫探針的抗體稀釋液，所述抗體稀釋液采用包含0.1wt-%明膠和0.05% (v/v)吐溫-20的pH值為7.0-8.0、濃度為0.01-0.05M的磷酸鹽緩沖液，25-37。。孵育0.5_2h后，以PBST洗滌液洗滌3?5次;
[0043]d.在前述酶標板的不同孔中再分別加入顯色液，25_37°C顯色10_30min，最后每孔加入作為終止液的、濃