基于新型印跡識別的甲硝唑電化學傳感器及制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于臨床分析及食品安全監控領域，特別涉及基于新型印跡識別，即基于 雙層異質分子印跡聚合物的甲硝唑電化學傳感器及制備方法與在醫藥、臨床、食品及其相 關產品(如飼料等）硝基咪唑類藥物分析監測中的應用。
【背景技術】
[0002] 甲硝唑屬于5-硝基咪唑類藥物(其中.英文名稱和結構見圖1)，具有抗菌和抗原 蟲活性，常用于治療人類滴蟲病、梨形鞭毛蟲病、阿米巴性肝膿腫等疾病。研究表明，過度使 用或濫用甲硝唑藥物，會造成其在人體內蓄積，達到或超過一定量后會誘發癲癇、周圍神經 病變及紊亂等疾病。甲硝唑也用于防治家禽的滴蟲病、豬的出血性下痢及厭氧菌感染，同時 還具有促生長和提高飼料喂養效率的作用。若被不合理使用及濫用于畜禽飼料或添加劑 中，則可能導致可食性動物組織中的藥物殘留，造成食品安全隱患，最終損害人類健康。我 國、歐盟和美國等均禁止甲硝唑等藥物用于食品動物。因此，檢測醫藥、體液、食品動物及飼 料等相關產品中甲硝唑含量，對醫藥、臨床醫療和保障食品質量安全都具有重要的現實意 義。已報道的甲硝唑測定方法主要有分光光度法、色譜法、免疫檢測法及電化學法等。這些 方法或選擇性、靈敏度難以達到實際測定的要求，或儀器設備昂貴，難以推廣應用。
[0003] 甲硝唑的化學結構式、中英文名稱和英文縮寫 人體或食品中殘留的甲硝唑一般含量甚微，屬于微量或痕量分析范疇。而在眾多微/ 痕量檢測新技術的研究中，傳感器技術由于具有高選擇性、低檢出限、簡便快捷、適合現場 監測等特性，一直是分析化學領域中最受關注的熱點；作為傳感器的識別元件一一能選擇 性識別和響應目標分析物的敏感膜，又是研究的核心和必須解決的關鍵問題。已報道的 這類識別元件主要有兩大類：一類是酶、抗體、受體、核酸等；以這類天然產物為識別元件 的傳感器具有優良的選擇性，但也存在穩定性差、使用壽命短等不足。另一類是具有仿生 功能的人工合成化合物，其中最受關注的當屬分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP)。該技術模擬天然受體與靶標分子之間"鎖與鑰匙"的相互作用模式，使MIP 與模板分子再結合時具有了分子記憶功能，可選擇性識別和響應目標分析物。傳統MIP通 常利用單烯烴衍生物作為功能單體，在模板分子存在下，與交聯劑通過自由基聚合反應來 制備。用該法及改良法制備的MIP雖然賦予傳感器較高的識別選擇性，但有模板洗脫難、傳 質效率低及溶劑致溶脹性等缺點。
[0004] 解決這些問題的替代方法是通過溶膠-凝膠法制備分子印跡聚硅氧烷 (molecularly imprinted siloxane, MIS)。基于MIS的傳感器除了兼備傳統MIP傳感器 的優點外，最突出特點是其增強的親水性使印跡位點在水溶液中與模板分子再結合能力不 受影響，且幾無溶劑導致的溶脹性。但MIS的絕緣性在很大程度上仍將影響傳感器的傳導 效率。
[0005] 近年來出現的電聚合法制備MIP技術，能在任何形狀的電極表面牢固地沉積一層 結構均一、密度和厚度可控的分子印跡膜，并且使該敏感膜與轉換器間的直接作用成為可 能。此法一般適用于絕緣型MIP修飾電極測定在MIP制備條件下無電活性的物質。如果模 板有電活性，則自身可能發生電化學反應而改變其結構；另一方面，導電型MIP雖可實現敏 感膜與電極之間的直接傳導，但模板或探針分子若不經印跡識別，直接在導電膜表面發生 反應，則會降低導電型MIP傳感器的選擇性。
[0006] 綜上所述，研發新型基于雙層異質分子印跡聚合物的甲硝唑電化學傳感器制備方 法，將為電化學傳感器開拓新的研究平臺，為醫藥、臨床檢驗和食品安全與質量監控提供新 技術，不僅具有重要的學術價值，也具有廣闊的實際應用價值。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的之一是提供一種基于新型印跡識別的甲硝唑電化學傳感器。
[0008] 實現本發明上述目的的技術方案是：一種基于新型印跡識別的甲硝唑電化學傳感 器，其是采用如下方法制成的： 一、 制備碳糊電極：將石墨粉和石蠟油以重量比74~94:26~6在研缽中充分混勻成碳 糊，然后將其緊密填充入聚丙烯塑料管中，管子的一端插入導線作為外電路連接點，將另一 端端面的碳糊打磨成光滑的鏡面，制成碳糊電極； 二、 制備表面含烷氧硅基的聚苯胺型導電膜碳糊電極：將上述制備的碳糊電極置于含 0·08~0·12 mol L1功能單體AMTEOS的0·15~0·25 mol L 1硫酸溶液中，電位循環掃描 13~17圈，電位掃描范圍為-0. 8~1.2 V，掃描速率為100~140 mV s1，在電極表面沉積含烷 氧硅基的聚苯胺型導電膜，所得電極簡稱為導電膜碳糊電極，用乙醇洗滌備用； 三、 制備雙層異質分子印跡聚合物膜修飾碳糊電極（CPE/HDL-MIP):首先按配比將氨丙 基三甲氧基硅烷（APTMS)、四乙氧基硅烷（TE0S)、2-乙氧基乙醇與含0. 01~0. 05 mol L-I 甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液混合，30~50°C攪拌至均勻；然后加入0.1 mol L-I NaOH溶液 和去離子水，再攪拌至溶膠形成；APTMS、TE0S、2-乙氧基乙醇、含0. 01~0. 05 mol L-I甲 硝唑的2-乙氧基乙醇溶液、0.1 mol L-I NaOH溶液和去離子水的體積配比為1~3 :2~10 : 40~100 :10~18 :2~8 :1~2 ;取此溶膠5~20 PL滴涂到第二步制備的導電膜碳糊電極表面，室 溫下靜置過夜、使電極表面修飾層發生水解-縮聚反應，形成雙層異質分子印跡聚合物膜， 同時使溶劑蒸發；最后，將該電極用有機溶劑反復清洗，直至甲硝唑被完全洗除干凈，得到 雙層異質分子印跡聚合物膜修飾碳糊電極（CPE/HDL-MIP); 四、 組裝基于新型印跡識別的甲硝唑電化學傳感器：將第三步制備的雙層異質分子印 跡聚合物膜修飾碳糊電極（CPE/HDL-MIP)與具有差分脈沖伏安掃描功能的電化學裝置連 接，即組裝成本發明基于新型印跡識別的甲硝唑電化學傳感器，本發明傳感器采用常規三 電極系統，CPE/HDL-MIP作為工作電極。
[0009] 本發明的目的之二是提供一種基于新型印跡識別的甲硝唑電化學傳感器的制備 方法。
[0010] 實現本發明上述目的的技術方案是：一種基于新型印跡識別的甲硝唑電化學傳感 器的制備方法，其包括如下步驟： 一、 制備碳糊電極：將石墨粉和石蠟油以重量比74~94:26~6在研缽中充分混勻成碳 糊，然后將其緊密填充入聚丙烯塑料管中，管子的一端插入導線作為外電路連接點，將另一 端端面的碳糊打磨成光滑的鏡面，制成碳糊電極； 二、 制備表面含烷氧硅基的聚苯胺型導電膜碳糊電極：將上述制備的碳糊電極置于含 0·08~0·12 mol L1功能單體AMTEOS的0·15~0·25 mol L 1硫酸溶液中，電位循環掃描 13~17圈，電位掃描范圍為-0. 8~1.2 V，掃描速率為100~140 mV s1，在電極表面沉積含烷 氧硅基的聚苯胺型導電膜，所得電極簡稱為導電膜碳糊電極，用乙醇洗滌備用； 三、 制備雙層異質分子印跡聚合物膜修飾碳糊電極（CPE/HDL-MIP):首先按配比將氨丙 基三甲氧基硅烷（APTMS)、四乙氧基硅烷（TE0S)、2-乙氧基乙醇與含0. 01~0. 05 mol L-I 甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液混合，30~50°C攪拌至均勻；然后加入0.1 mol L-I NaOH溶液 和去離子水，再攪拌至溶膠形成；APTMS、TE0S、2-乙氧基乙醇、含0. 01~0. 05 mol L-I甲 硝唑的2-乙氧基乙醇溶液、0.1 mol L-I NaOH溶液和去離子水的體積配比為1~3 :2~10 : 40~100 :10~18 :2~8 :1~2 ;取此溶膠5~20 PL滴涂到第二步制備的導電膜碳糊電極表面，室 溫下靜置過夜、使電極表面修飾層發生水解-縮聚反應，形成雙層異質分子印跡聚合物膜， 同時使溶劑蒸發；最后，將該電極用有機溶劑反復清洗，直至甲硝唑被完全洗除干凈，得到 雙層異質分子印跡聚合物膜修飾碳糊電極（CPE/HDL-MIP); 四、 組裝基于新型印跡識別的甲硝唑電化學傳感器：將第三步制備的雙層異質分子印 跡聚合物膜修飾碳糊電極（CPE/HDL-MIP)與具有差分脈沖伏安掃描功能的電化學裝置連 接，即組裝成本發明基于新型印跡識別的甲硝唑電化學傳感器，本發明傳感器采用常規三 電極系統，CPE/HDL-MIP作為工作電極。
[0011] 本發明的目的之三是提供一種基于新型印跡識別的甲硝唑電化學傳感器的應用。
[0012] 實現本發明上述目的的技術方案是：基于新型印跡識別的甲硝唑電化學傳感器應 用在醫藥、臨床、食品及其相關產品(如飼料等）硝基咪唑類藥物監測中。
[0013] 本發明利用分子中同時含有能生成導電聚合物和硅氧縮聚物兩類基團的苯胺甲 基三乙氧基硅烷（anilinomethyltriethoxysilane，AMTE0S)作為功能單體，首先通過電聚 合在碳糊電極（carbon paste electrode，CPE)表面形成導電聚合物層，然后在模板分子 甲硝唑存在下，使連于硅原子上的乙氧基水解-縮聚，在該導電聚合物表面生成硅氧縮聚 物分子印跡膜，即在電極表面形成具有雙層異質結構的分子印跡聚合物（heterogeneous double-layered-based molecularly imprinted polymer，HDL-MIP)膜；位于外層的娃氧 縮聚物具有親水性和結構剛性等特點，其印跡位點的大小、形狀、官能團分布均可根據模板 分子的空間結構任意裁剪；位于內層的導電聚合物既具有"分子導線"功能，使電極與印跡 膜之間的信號傳遞更加高效，又能使HDL-MIP牢固地整體"電鍍"于電極表面，所含官能團 還可協同外層MIS增強與模板分子的相互匹配-識別作用。
[0014] 因此，基于新型印跡識別的甲硝唑電化學傳感器集成了導電分子印跡聚合物和分 子印跡硅氧縮聚物二者的優勢，實現了硝基咪唑類分子與轉換器之間直接高效的信號轉 換，并且具有增強的印跡識別能力。該類新型傳感器還具有廣泛的適用性，不僅可用于電活 性物質如硝基咪唑類藥物的傳感測定，也能用于非電活性物質的含量分析。
[0015] 本發明基于新型印跡識別的甲硝唑電化學傳感器可用于各種劑型醫藥品中甲硝 唑的含量分析，臨床血清、血衆、尿液等體液中甲硝唑的含量檢測，也可用于食品如蜂蜜、牛 奶、禽肉以及與之相關物如飼料等產品中甲硝唑的含量監測，其測定步驟如下： 第一步，建立校正曲線(或稱工作曲線）及校正曲線方程： 用無水乙醇配制25 mmol L 1甲硝唑儲備溶液，再用Britton - Robinson緩沖液（BR 緩沖液，pH 3. 5~6.0)稀釋成不同濃度的甲硝唑系列標準溶液，用本發明的傳感器測定系 列標準液中甲硝唑含量，測定時采用差分脈沖伏安法（differential pulse voltammetry， DPV)，記錄掃描的伏安數據，掃描結束后，從DPV曲線-0.4 V處讀出對應該濃度甲硝唑的 陰極還原峰電流/p。取出工作電極，用有機溶劑反復清洗，然后用DPV法檢驗，若-0.4 V 處再無甲硝唑的陰極還原峰出現，說明電極已清洗干凈。此時該工作電極又可繼續用于下 一次測定。以同一濃度甲硝唑標準液平行測定三次的Λ平均值(單位為微安，μΑ)為縱坐 標，以對應的標準溶液濃度c (單位為微摩爾每升，μπιο? Γ1)為橫坐標，作校正曲線，并建 立校正曲線方程，其形式為： /ρ