發光聚合物循環擴增的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種在液體試樣中利用一個具有小表面積的探針和一個具有多個結 合分子和多個熒光或化學發光法標記的支化聚合物以探測被分析物的方法。這個方法的敏 感性是通過多次循環結合反應和擴增反應來提高的。
【背景技術】
[0002] 在許多免疫分析應用中需要發展高靈敏度的測定方法。發光染料，發射熒光或化 學發光信號，提供了若干實用性的優點，例如：穩定性，低成本，適合于標記步驟和最小限度 的受生物試樣或固相底物干擾的光譜性質。與其他測定方法相比，熒光染料法有一個缺點， 特別是ELISA，其酶活力擴增了與免疫復合物結構相關的可測信號的總量。
[0003] 芳基磺酸酯花青焚光染料被描述于Mujumdar等（1993) Bioconjugate Chemistry，4:105_lll;Southwick 等（1990)Cytometry，11 :418-430;和美國專利 號5,268,486。每一篇參考文獻都描述了 Cy5,并且其可以從賓夕法尼亞州匹茲堡的 Biological Detection Systems公司買到，商品名為FLU0R0LINK?Cy5?。該芳基橫酸酯花 青熒光染料具有高消光系數（通常為130, 000升/摩爾至250, 000升/摩爾），優良的量子 產率，在大多數生物材料和塑料的自體熒光波長范圍以外（500納米至750納米）的熒光發 射譜，優良的溶解性，以及低非特異性結合特性。
[0004] 盡管有這些優異性能，芳基磺酸酯花青熒光染料也存在某些限制。特別是，這些染 料的斯托克斯頻移相對較窄，其導致該染料的激發和發射譜之間的明顯重疊。當這些染料 分子在受激發時彼此位置接近時，該激發和發射譜的重疊可以引起熒光的自熄滅。這種自 熄滅限制了可以結合至單個抗體分子用于免疫分析的芳基磺酸酯染料分子的數目。在示范 性的芳基磺酸酯花青熒光染料Cy5的情況下，斯托克斯頻移是17納米（其為650納米的激 發波長和667納米的發射波長之差）。當兩至四個Cy5分子被結合至單個抗體分子時，獲得 最佳的熒光產率。當超過四個染料分子被結合至單一抗體分子時，該熒光信號輸出迅速下 降。這種不能結合超過四個染料分子至單一的抗體分子的特性明顯限制了使用Cy5-標記 的抗體及其它結合物質的免疫分析的靈敏度。
[0005] 美國公開2001/0312105公開了一個探測系統和熒光免疫分析；該公開的整體以 參考方式被合并于此。該公開沒有公開通過探針在試劑容器和擴增容器來回地循環得到擴 增。
[0006] 需要有改善的方法，用于通過熒光或化學發光法免疫分析以高靈敏度檢測被分析 物。該方法應易于由用戶操作，并應提供高特異性的信號和最小的背景噪聲。
【發明內容】
[0007] 本發明涉及用于探測在液體試樣中具有高敏感性的被分析物的發光免疫分析方 法。該方法包括步驟：(a)獲得一探針，其具有被固定在該探針梢端上的第一抗體；(b)將該 探針梢端浸入包含具有被分析物的樣品溶液的樣品容器中，將被分析物與在探針梢端的第 一抗體結合；（C)將該探針梢端浸入包含試劑溶液的試劑容器，該試劑溶液包括和一結合 配對的第一成員結合的第二抗體分子試劑以結合該試劑和被分析物；（d)將該探針梢端浸 入含洗液的洗滌容器中來洗滌探針梢端；（e)將該探針梢端浸入含有擴增溶液的擴增容器 中，該擴增溶液中含有一聚合物，該聚合物結合有至少5個分子的該結合配對的第二成員 和至少25個熒光標記，以在該探針梢端上形成該被分析物，該第一抗體，該第二抗體，和該 結合配對的第一和第二成員間的免疫復合體，其中該聚合物是分支的，并且其分子量至少 為約一百萬道爾頓，發光標記的分子質量小于2000道爾頓；（f)將該探針梢端浸入含第二 洗液的第二洗滌容器以洗滌探針梢端；（g)重復步驟（c)至（f) 1-10次，以及（g)通過測定 在探針梢端的發光信號來探測免疫復合物。
[0008] 本發明還涉及到一個組合物，包括（a)具有分子量至少一百萬道爾頓的支化聚合 物，（b)至少5個結合分子，并且（c)至少25個選自三（雙吡啶）合^!了（II) (ruthenium(II) tris-bipyridine)，魯米諾，叮啶酯，和氯化血紅素的化學發光分子；其中結合分子和化學 發光分子被結合到聚合物上。
【附圖說明】
[0009] 圖1顯示了用于探測探針傳感表面的熒光信號的光學探測系統。
[0010] 圖2顯示了用于探測在探針梢端的化學發光信號的電化學發光探測系統。
[0011] 圖3顯示了用于檢測抗原被分析物的免疫分析形式。Ab :抗體，Ag :抗原，Sa :鏈霉 親和素 ，B :生物素 ，F :熒光標記。
[0012] 圖4顯示了在循環擴增中的探針轉移。
[0013] 圖5顯示了制備交聯ficoll 400-SPDP的流程圖。
[0014] 詳細說明
[0015] 定義
[0016] 除非在下文定義，權利要求和說明書中使用的術語將根據本領域技術人員所理解 的通常含義進行解釋。
[0017] 此處使用的"約"指在所列舉值的± 10%以內。
[0018] 此處使用的"結合被分析物的分子"指能參與和被分析物分子的特異性結合反應 的任何分子。
[0019] 形狀的"縱橫比"指其較長尺寸與其較短尺寸的比率。
[0020] "結合分子"指能夠結合另一個感興趣的分子的分子。
[0021] 此處使用的"結合配對"指彼此吸引并特異性結合的兩個分子。結合配對的例子 包括，但不限于，抗原和針對該抗原的抗體，配位體及其受體，核酸的互補鏈，生物素和抗生 物素蛋白（avidin)，生物素和鏈霉親和素，生物素和親和素（neutravidin)(去糖基化的版 本的抗生物素蛋白（avidin))，凝集素和糖類。優選的結合配對是生物素和鏈霉親和素，生 物素和抗生物素蛋白（avidin)，生物素和親和素（neutravidin)，熒光素和抗熒光素，異羥 基洋地黃毒苷/抗異羥基洋地黃毒苷（digioxigenin/anti-digioxigenin)，DNP (二硝基苯 酚）和抗-DNP。
[0022] 此處使用的"支化聚合物"指一個非線性聚合物，其具有二或三維結構，其可能是 天然存在的支化聚合物，或一個合成交聯聚合物。
[0023] 此處使用的"化學發光"指能量的釋放伴隨有限的冷光的釋放，是一個化學反應的 結果。例如，當魯米諾在有合適催化劑時與過氧化氫反應，產生處于激活態的3-氨基鄰苯 二甲酸鹽，它在衰變到低能量級時發光。
[0024] 此處使用的"樹狀聚合物"指重復的有機的支化分子。一個樹狀聚合物一般對稱 地環繞于核心，且通常采取球狀三維結構。
[0025] 此處使用的"電化學發光"(ECL)指在溶液中的電化學反應中產生的冷光。在電化 學發光中，電化學產生的中間體經過一個高放能反應產生一個電子激活態，然后發光。ECL 激發是由電子產生的物質經高能電子轉移反應（氧化還原反應）引起的。ECL通常可以通 過向含有發光物質溶液的電化學電池的電極施加電位（若干伏特）觀察到。
[0026] 此處使用的"被固定"指試劑被固定在固體表面上。當試劑被固定至固體表面時， 其可以被非共價或共價地結合至該表面。
[0027] 此處使用的"整體式襯底"指具有一個折射指數的單塊固體材料。
[0028] 此處使用的"探針"指在傳感側包覆有被分析物結合分子的薄膜層的襯底。探針 具有遠端和近端。該近端（在此申請中也稱為探針梢端）具有用被分析物結合分子的薄層 包覆的傳感表面。
[0029] 高敏感度發光免疫分析
[0030] 本發明涉及一個高敏感度免疫分析方法。發明人已經發現，一個獨特的組合（i) 利用具有曉得傳感表面積用以結合被分析物分子的探針，（ii)利用一個與復合分子和復合 發光標記結合的高分子量的支化聚合物，并且（iii)具有免疫復合物結構的探針循環地返 回試劑容器和擴增容器1-10次并且與試劑和擴增聚合物重復反應，改善探測水平的敏感 度。本發明涉及一個高敏感度免疫分析方法。發明人已經發現，（i)利用具有小的用以結 合被分析物分子的傳感表面積的探針，（ii)利用一個與多個結合分子和多個發光標記結合 的高分子量的支化聚合物，以及（iii)將具有形成的免疫復合物的探針循環地返回試劑容 器和擴增容器1-10次并且重復與試劑和擴增聚合物的反應的獨特組合，改進了探測水平 的敏感度。對每個循環，發光信號比噪音提高顯著。
[0031] 本方法提供了高靈敏度和精密度而不增加分析試劑，消耗品和測量儀器整體的復 雜度。本方法要求探針反復地在兩個試劑間轉移，其中一個是帶有多個結合分子和多個發 光標記的擴增聚合物。聚合物具有分子量多400K，優選多一百萬道爾頓。聚合物的交聯希 望能控制分子大小的分布和非特異性結合。聚合物應攜帶最少5個結合分子每個聚合物， 優選大于10個。發光標記應較小，其分子量<5K道爾頓。發明人已經發現不用如上所述 在擴增中的聚合物而簡單地循環反應沒有提高靈敏度。
[0032] 本方法探測在液體試樣中被分析物。該方法包括步驟：(a)獲得一探針，其具有被 固定在該探針梢端上的第一抗體，其中該梢端表面的直徑< 5毫米；(b)將該探針梢端浸入 包含具有被分析物的樣品溶液的樣品容器中，將被分析物與在探針梢端的第一抗體結合； (C)將該探針梢端浸入包含試劑溶液的試劑容器，該試劑溶液包括和一結合配對的第一成 員結合的第二抗體分子試劑以結合該試劑和被分析物；（d)將該探針梢端浸入含洗液的洗 滌容器中來洗滌探針梢端；（e)將該探針梢端浸入含有擴增溶液的擴增容器中，該擴增溶 液中含有一聚合物，該聚合物結合有至少5個分子的該結合配對的第二成員和至少25個熒 光標記，以在該探針梢端上形成該被分析物，該第一抗體，該第二抗體，和該結合配對的第 一和第二成員間的免疫復合體，其中該聚合物是支化的，并且其分子量至少為約一百萬道