用于檢測小反芻獸疫病毒血凝素蛋白抗體的試劑盒及其使用方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及用于檢測小反芻獸疫病毒血凝素蛋白抗體的試劑盒及其使用方法。
【背景技術】
[0002] 小反芻獸疫是我國農業部制定的《法定動物疫病病種名錄》中規定的I類動物疫 病。在周邊國家相繼發生此病后，自然的地理屏障一喜馬拉雅山脈最終被突破，2007年該疫 病在我國西藏發生，對我國動物衛生安全造成了嚴重威脅。
[0003] 自2007年我國確診在西藏阿里地區暴發了一起山羊小反芻獸疫疫情后，到目前 為止，我國新疆、甘肅、內蒙、貴州等20多個省區發生了小反芻獸疫疫情。小反芻獸疫危害 著我國西部地區養羊業的發展，因此對疫情的監視和控制是防止小反芻獸疫進一步擴散首 要的任務。
[0004] 麻疹病毒屬的病毒都是親淋巴細胞性，可使各自宿主發生災難性疾病，伴隨有嚴 重的淋巴細胞減少和免疫抑制。病毒與宿主易感細胞上的特異性受體分子相結合而啟動其 復制過程，是病毒進入細胞的第一步，是病毒進入宿主細胞的"核心"機制。H糖蛋白的主要 作用是與宿主細胞膜受體結合，并調節病毒的吸附及入侵宿主細胞。同時，H蛋白也是病毒 的主要抗原成份和引起宿主細胞病變（CPE)的決定因素。
[0005] 近年來，國內外學者利用多種表達體系對H蛋白的表達和功能進行了研究，該蛋 白可在多種表達系統中表達，但由于編碼基因自身特征，表達量均不高。在表達系統中， 原核系統如E. coli比哺乳動物細胞和昆蟲表達系統更為經濟，也因為其簡單、容易大批生 產以及不用翻譯后修飾而被廣泛使用。此外，現有研究發現去除胞內區域的截短H蛋白 (truncated H protein)仍具有正常的與細胞受體結合的能力。
【發明內容】
[0006] 本發明提供了用于檢測小反芻獸疫病毒血凝素蛋白抗體的試劑盒及其使用方法。
[0007] 本發明提供一對用于擴增小反芻獸疫病毒血凝素蛋白（H蛋白)胞外區基因的特異 性引物，所述特異性引物為： 上游引物：5'GGGATCCATGAGGCTTCACCGAGCCACC3' ； 下游引物：5，CCAAGCTTCTAGACTGGATTACATGTTACCTC3'。
[0008] 本發明提供一種用于檢測小反芻獸疫病毒血凝素蛋白（H蛋白）抗體的試劑盒，所 述試劑盒以小反芻獸疫病毒血凝素蛋白基因胞外區序列編碼的重組蛋白為包被抗原。
[0009] 優選地，所述重組蛋白的制備方法為：將小反芻獸疫病毒血凝素蛋白基因胞外區 序列擴增后克隆至pET_30a(+)表達載體的多克隆位點處，獲得重組表達質粒，將重組質粒 轉入宿主感受態細胞中，在IPTG誘導下表達，純化后得到重組蛋白。
[0010] 更進一步地，所述重組蛋白的制備方法為：（1)合成引物，上游引物：5'GGGATCCAT GAGGCTTCACCGAGCCACC3'，下游引物：5' CCAAGCTTCTAGACTGG ATTACATGTTACCTC3' ；（2)通過 RT-PCR方法從小反芻獸疫病毒RNA中獲得長度為1653bp的片段，將該片段構建到原核表 達載體pET-30a(+)中得重組質粒pET-30a(+)-tH ; (3)將重組質粒轉化BL-21宿主菌，用 IPTG誘導表達，純化得到重組蛋白。
[0011] 優選地，所述重組蛋白的氨基酸序列參見SEQ ID No. 2。
[0012] 優選地，所述試劑盒還包括酶標二抗，所述酶標二抗為鼠抗羊酶標二抗，所述酶為 辣根過氧化物酶；優選地，所述酶標二抗的稀釋度為1:30000。
[0013] 優選地，所述試劑盒中包被抗原的包被量為I. 0 μ g/孔。
[0014] 本發明的第二個目的是提供上述試劑盒的使用方法，步驟如下： (1) 包被酶標板：用純化后的重組蛋白包被酶標板，洗滌； (2) 封閉酶標板，洗滌；封閉劑優選含有5%脫脂奶粉的PBST ; (3) 加入待檢血清，反應后洗滌；優選地，稀釋倍數為1:80 ; (4) 加入酶標二抗，反應后洗滌；所述酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的鼠抗羊酶標二 抗；優選地，稀釋倍數為1:30000倍； (5) 顯色，終止，在酶標儀上讀取漢?45。的光吸收值； (6) 結果判定：當待檢血清的嫩45。值多0. 57時，則判為陽性；當待檢血清的嫩45。值 < 0. 47時，則判為陰性；當0. 47彡待檢血清的漢)45。值< 0. 57時，為可疑陰性。
[0015] 本發明的第三個目的是提供小反芻獸疫病毒血凝素蛋白基因胞外區序列編碼的 重組蛋白在檢測小反芻獸疫病毒中的應用，所述應用不以活的人體或動物體及其離體樣品 為檢測對象。
[0016] 優選地，所述重組蛋白的氨基酸序列參見SEQ ID No. 2。
[0017] 本發明的第四個目的是提供小反芻獸疫病毒血凝素蛋白（H蛋白）抗體的檢測方 法，步驟如下： (1) 包被酶標板：用純化后的重組蛋白包被酶標板，洗滌； (2) 封閉酶標板，洗滌；封閉劑優選含有5%脫脂奶粉的PBST ; (3) 加入待檢血清，反應后洗滌；優選地，稀釋倍數為1:80 ; (4) 加入酶標二抗，反應后洗滌；所述酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的鼠抗羊酶標二 抗；優選地，稀釋倍數為1:30000倍； (5) 顯色，終止，在酶標儀上讀取漢?45。的光吸收值； (6) 結果判定：當待檢血清的嫩45。值多0. 57時，則判為陽性；當待檢血清的嫩45。值 < 0. 47時，則判為陰性；當0. 47彡待檢血清的漢)45。值< 0. 57時，為可疑陰性。
[0018] 應用本發明的方法能夠快速而特異地檢測血清中小反芻獸疫病毒H蛋白抗體，反 應特異性好，靈敏度高，其操作簡單、成本低廉，反應結果穩定可靠、易于觀察，非常適用于 小反芻獸疫的進出口檢疫、食品衛生以及畜牧飼養場的大批樣品的篩查，易于大范圍推廣 應用。與OIE推薦的"小反芻獸疫競爭ELISA試劑盒（PPR competitive ELISA kit) "(BDSL 公司，Biological Diagnostic Supplies Ltd, France)的對比檢測符合率為 96. 4%〇
【具體實施方式】
[0019] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。
[0020] 實施例1 一、小反芻獸疫病毒（PPRV)血凝素蛋白（H)胞外區重組蛋白（tH蛋白）的制備 1、引物設計 根據GenBank登載的PPRV Nigeria 75/1株序列（登錄號：X74443)中H基因胞外區 (tH)序列設計引物。
[0021] h游引物：5' GGGATCCATGAGGCTTCACCGAGCCACC3' ； 下游引物：5' CCAAGCTTCTAGACTGGATTACATGTTACCTC3'。
[0022] 其中，劃橫線部分分別為及_^1和III酶切位點。
[0023] 2、RT-PCR 擴增 (1) 提取小反芻獸疫疫苗株Nigeria 75/1細胞毒RNA ; (2) RT-PCR擴增，獲得tH片段（1653Βρ)3Η片段的核苷酸序列見序列表SEQ ID No. 1。
[0024] 具體反應體系及反應條件為：反應體系：25 μ 1總體系中總RNA0. 5 μ g， 5XbufTer5yl，10mmol/LdNTP0.5yl，DTT1.25yl，弓丨物（上游 + 下游）2μ1，酶（mix) 0·5μl，剩余為DEPC水。反應條件：95°C預熱變性5min;94°C，lmin ;53°C，lmin;72°C， 100s，35 個循環，72Γ，IOmin ;4Γ，30min。
[0025] (3)將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在1653bp左右處出現一條特異電泳條帶， 與預期的大小一致。
[0026] (4 )將擴增產物連接到原核表達載體pET_30a (+)中，取用及油"1和份 III pET-30a (+)雙酶切的 pET-30a (+)載體 1 μ L (50 μ g/ μ L)與上述 RT-PCR 片段 3 μ L 混 合后，加入 2XRapid ligase buffer 5yL，T^NA 連接酶 IyL (3u/yL)，混勻后置 4°C 連 接過夜，得到重組質粒pET-30a (+)-tH。
[0027] (5)將重組質粒轉化至A cWi BL21感受態細胞，用含氨芐青霉素的LB培養基篩 選；用IPTG誘導表達，并優化、確定蛋白的最佳表達條件。該重組蛋白的氨基酸序列參見序 列表 SEQ ID No. 2。
[0028] 灰度掃描分析發現，經IPTG誘導的重組基因工程菌獲得表達，產生分子量大小約 為60kDa的特異性蛋白條帶，重組tH蛋白主要以包涵體形式表達。通過改變誘導溫度、誘 導時間和IPTG濃度來增加重組tH蛋白的表達量，SDS-PAGE分析顯示，按1 %比例接入二 級種子液，3