血清高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫學及生物化學技術領域，尤其涉及血清高密度脂蛋白中膽固醇的測 定試劑。
【背景技術】
[0002] 血清膽固醇濃度可作為人體脂類代謝的標志。高密度脂蛋白膽固醇（HDL)是體 積最小的脂蛋白，和其他脂蛋白相比，HDL含蛋白量最大（>50% )，其主要的載脂蛋白為 APOA- I、A- II、及少量的APO-C、E ;磷脂是其主要的脂質，還有少量的膽固醇、膽固醇酯 和甘油三酯在卵磷脂膽固醇酰基轉移酶（LCAT)的作用下，游離膽固醇變成膽固醇酯，經過 HDL將蓄積在組織的游離膽固醇運送到肝，減少血漿HDL中游離膽固醇的濃度，形成膽固醇 從細胞膜流向血漿脂蛋白的濃度梯度，降低組織膽固醇的沉積，從而限制動脈粥樣硬化的 發生、發展，起到抗動脈粥樣硬化作用。所以，血漿中HDL和動脈粥樣硬化的發生成負相關， 臨床醫學可用HDL-C來評價患冠心病（CHD)的危險性。
[0003] 對高密度脂蛋白膽固醇的傳統測定方法有超速離心法、電泳法以及沉淀法，超速 離心法是根據脂蛋白的比重不同，用超速離心器把脂蛋白進行分類，再對膽固醇進行測定， 該方法通過超速離心和膽固醇檢測兩個過程，費時費力，且費用較高；電泳法需要借用一些 如瓊脂糖凝膠等作為載體分離，操作及其繁雜，且準確度偏低；沉淀法是使用多聚陰離子和 二價金屬離子試劑沉淀大顆粒的脂蛋白，然后離心，再用其上清液檢測其含量，該方法雖然 簡便，但僅限于個別或少數樣本檢測，而且對高甘油三酯血癥患者檢測時，會造成結果偏高 的誤差，影響最終判斷結果。
[0004] 近年來，隨著臨床醫學的深入發展，高密度脂蛋白膽固醇檢測（HDL-C)已實現了 全自動化，而HDL-C試劑是實現全自動檢測的關鍵，其品質高低直接影響了檢測數據的準 確性。目前，有關HDL-C試劑的報道較多，如專利CN 1632541 A公開了高密度脂蛋白中膽固 醇的測定試劑及制備方法，披露了由"適量防腐劑、穩定劑、色原、高親和性酶化合物和表面 活性劑"制成的HDL-C試劑，該試劑實現了高密度脂蛋白中膽固醇全自動檢測，解決了傳統 檢測方法存在的不足，并且提高了檢測準確度，相關性達到0.98以上；CN 1696659 A公開 了一種測定低密度脂蛋白膽固醇試劑及制備方法，披露了由"適量緩沖液、穩定劑、色原、高 親和性酶化合物和表面活性劑"制成的試劑，該試劑實現了低密度脂蛋白中膽固醇全自動 檢測，解決了傳統檢測方法存在的不足，并且提高了檢測準確度，相關性達到〇. 98以上。上 述兩篇文件均公開了由高親和性酶化合物作檢測物質的技術方案，但該兩篇文件中的高親 和性酶化合物制備方法簡單，制備時沒有對酶進行活化處理，存在酶與化合物反應時間長， 且反應不充分，進而影響了酶化合物的整體性能與產量。此外，有關高密度脂蛋白中膽固醇 的測定試劑的報道都采用高分子量化學成分制備，化合物制備價格高且純度低，進而影響 檢測結果。如專利CN 102041296 A公開的一種血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C)勻相法 體外診斷試劑；CN 101078729 A公開的高密度脂蛋白膽固醇的測定方法等。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于：提供一種血清高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑，通過酶的 選擇、預培養、活化培養及脫水反應等步驟提高酶的活性，再與經催化活化處理的化合物混 合反應，提高測定試劑靈敏度，進而提高檢測結果準確性。
[0006] 為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0007] 血清高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑，包括適量防腐劑、穩定劑、色原、高親和 性酶化合物、表面活性劑、牛血清白蛋白，其特征在于：所述的高親和性酶化合物是按照以 下方法制備得到：
[0008] 1)酶的活化：
[0009] ①酶的選擇：膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶和脂蛋白脂酶，三者按照5~1 :1~5 : 1~1. 5的比例混合；
[0010] ②酶的預培養：將上述混合酶置于溫度32~39°C、pH值5. 5~8的緩沖溶液中預 培養3~8小時，其中，所述的緩沖溶液是磷酸鹽緩沖溶液或檸檬酸緩沖溶液；
[0011] ③酶的活化培養：經預培養的混合酶轉入由牛血清白蛋白、甘油、環糊精、 EDTA-Na溶液、青霉素及無菌水混合液中，在溫度34~39°C條件下活化培養5~10小時， 得到活化酶混合緩沖液A ;
[0012] ④脫水反應：采用吸水劑制備過濾柱，將上述活化酶混合緩沖液A緩慢流經過濾 柱，除去活化酶混合緩沖液中加入的游離水，并隨時調節緩沖液pH值，使其維持在5. 5~ 8 ；
[0013] 2)制備高親和性酶化合物
[0014] ①化合物選擇：甾類糖苷、三萜烯糖苷、蛋白質毒素和多烯類抗菌素中的一種或多 種組合化合物組合，并且化合物采用公知手段進行催化活化，得到活化化合物組合物B ;
[0015] ②混合反應：將步驟1)得到的活化酶混合緩沖液A和步驟2)得到的活化化合物 組合物B混合，并補充適量的緩沖溶液，在32~39°C條件下混合反應3~10小時，得到高 親和性酶化合物。
[0016] 進一步，所述的血清高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑由以下百分比的組分制 成：高親和性酶化合物68~73%、牛血清白蛋白23~30%、表面活性劑2. 4~2. 7%、防 腐劑1. 3~1. 5%、穩定劑I. 1~1. 5%、色原0. 2~0. 3%，以上組合總量為100%。
[0017] 進一步，所述的活化酶混合緩沖液A與活化化合物組合物B混合比例為：1~2 : 3 ~10〇
[0018] 進一步，在步驟③酶的活化培養中，所述的混合液組分配比為：牛血清白蛋白 50~60 %、甘油5~8%、β -環糊精1~3%、EDTA-Na溶液1~L 5 %、青霉素0· 5~ 0· 8%、無菌水34~37%。
[0019] 與現有血清高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑相比，本發明的有益效果在于：
[0020] 1、該試劑能夠在各種型號的全自動生化分析儀上對高密度脂蛋白中膽固醇進行 檢測，無需樣本離心、沉淀等繁雜操作，大幅降低了檢測工作量，縮短了檢測時間，降低了檢 測成本。
[0021] 2、該試劑性質穩定，在2~8°C條件下穩定12個月以上，不會出現試劑渾濁，變質 腐壞及凝聚現象，使用時僅需輕輕振蕩搖勻即可。
[0022] 3、該試劑特異性好、靈敏度高，檢測準確率高，與國家推薦的Friedewald公式檢 測結果比較，相關性達到0. 997以上。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合具體實施例對本發明的技術方案作進一步說明，旨在幫助同領域技術人 員理解。
[0024] 實施例1
[0025] 血清高密度脂蛋白中膽固醇