一種用于血型抗體檢測的試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于血型抗體檢測和鑒定技術領域，具體涉及一種用于血型抗體檢測的試劑盒及其在血型抗體檢測中的應用。
【背景技術】
[0002]血型鑒定在輸血治療中非常重要，血型鑒定是基于抗原-抗體反應導致的細胞凝集反應。使用紅細胞表面抗原檢測血清/血漿中的血型抗體稱之為反定型。在臨床輸血中，必須保證正、反定型法鑒定結果一致，才能確保輸血的安全性。目前大多數的反定型試驗都是以有活力的紅細胞表面抗原作為標準抗原，然而新鮮紅細胞不易保存，并且紅細胞表面抗原的抗原性隨保存時間延長而逐漸降低。這類試劑不僅需要低溫保存，且最長保存期只有3至6個月。
[0003]現有技術中所建立的紅細胞抗體檢測方法有試管法、紙片法、微柱凝集檢測卡法等。微柱凝集法是目前最常用的檢測方法，實驗時紅細胞抗原與相應抗體的反應在微柱凝集介質中進行，微柱凝集具有分子篩的作用，如果紅細胞抗原與相應抗體結合，形成的凝集塊經離心后不能通過分子篩而留在凝集介質的上層；如果紅細胞與抗體沒有結合，反應后沒有形成凝集塊，則離心后紅細胞可以通過分子篩沉淀到底部，從而達到鑒定ABO血型的目的。但是該方法干擾因素多，可能產生假陰性或假陽性檢測結果，導致檢測結果容易出現誤差。
[0004]CN103487590B公開了一種血型抗體的間接Dot-ELISA檢測方法與應用，所述方法為將硝酸纖維素膜固定于96孔板上，然后直接將紅細胞膜包被硝酸纖維素膜上，與待測抗體反應，通過酶標二抗形成抗原-抗體復合物。然而該方法操作復雜，不易實現，需肉眼判斷檢測結果，易產生誤差且無法實現定量檢測。
[0005]CN1032926A同樣公開了將已用酶標記的ABH單克隆抗體用斑點ELISA (酶聯免疫吸附法)進行ABO血型測定，通過結合在抗體上的酶作用底物出現顏色變化來判斷血型。同樣的，上述方法也需通過肉眼觀察顏色判斷檢測結果，易產生誤差并無法實現定量檢測。
[0006]A sandwich enzyme-linked immune-sorbent assay for ABO blood typing ofsemen by using anli_P84 monoclonal antibody as a marker of blood group substancein semen (Sato I et al.，J Forensic Sci，2000，45 (4):795)公開了利用 ELISA 法測定精液中的血型物質P84，實驗利用抗血型物質P84的單克隆抗體包板，捕捉精液或精斑樣本中的相應抗原，實驗證明即使樣本在40°C下保存8個月，樣本中仍有超過60%的P84血型物質生物學活性存在，仍然可以用這種辦法順利進行血型物質的鑒定。
[0007]為克服現有技術的缺陷，本發明提供了一種用于血型抗體鑒定和/或檢測的試劑盒及應用。
【發明內容】
[0008]本發明的一個目的是提供一種血型抗體鑒定和/或檢測方法，解決了現有檢測方法中只能定性或半定量檢測血液中血型抗體的缺陷，實現了對血型抗體特別是血液中存在的弱抗體定量鑒定和/或檢測，提高了輸血的安全性。
[0009]本發明的另一個目的是提供一種血型抗體鑒定和/或檢測方法，解決了現有檢測方法中操作繁瑣復雜的問題，能夠實現用十系及以上譜細胞進行不規則抗體的自動化和批量化檢測。
[0010]本發明的再一個目的是提供一種用于血型抗體鑒定和/或檢測的試劑盒，解決了現有檢測產品中紅細胞保存周期過短，檢測重現性差、不能實現檢測標準化的問題。
[0011]本發明的一方面提供了一種用于血型抗體鑒定和/或檢測的試劑盒，包括：固定有血型抗原的固相載體、補體、酶標記的抗補體和顯色液。
[0012]本發明所述的血型抗原是指人體紅細胞存在的抗原物質。可以理解，現有已知的紅細胞表面的抗原均可以被用于血型抗體鑒定和/或檢測，其取決于需要鑒定和/或檢測的血型抗體，優選的，所述的血型抗原為選自ABO血型系統、Rh血型系統、麗S血型系統、P血型系統、Kell血型系統、Kidd血型系統、Lewis血型系統、Duffy血型系統的抗原。所述的ABO血型系統抗原為A、B抗原，所述的Rh血型系統抗原為C、c、D、E、e抗原，所述的麗S血型系統抗原為M、N、S、s抗原，所述的P血型系統抗原為Pl抗原，所述的Kell血型系統抗原為K、k、Kpa、Kpb、Jsa、化^^原，所述的Kidd血型系統抗原為Jk a、見’允原，所述的Lewis血型系統抗原為Lea、Leb抗原，所述的Duffy血型系統抗原為Fy a、Fyb抗原。更優選的，所述的血型抗原為ABO血型系統抗原，即A抗原或B抗原。
[0013]本發明所述的固相載體作為吸附劑和容器，本身不參與化學反應。本發明所述的固相載體材質可以為聚苯乙烯、聚氯乙烯，優選為聚苯乙烯。更優選的，本發明所述的固相載體為微量滴定板或微孔板，包括8孔板、48孔板、96孔板，最優選的，本發明所述的固相載體為96孔板，更為優選的，本發明所述的固相載體為條與條之間可拆卸的微孔板。
[0014]本發明所述的補體能夠與抗原抗體復合物（例如IgG、IgM)反應，并且不與單獨的抗原和抗體反應，因此可以特異性的用于血型抗體的檢測中。Clq為各種補體分子中分子量最大（410kDa)的γ球蛋白，其分子結構較特殊和復雜，由Α、B、C三種不同類型的肽鏈所組成。Clq可以用于識別抗原抗體復合物，當Ig補體結合位點暴露時，Clq能與Ig受體部位結合，并由此導致Clq的活化。因此，本發明所述的補體優選為Clq補體，更優選的，本發明所述的試劑盒中補體Clq的濃度是O. 04-400 μ g/mL，最優選的，本發明所述的試劑盒中補體Clq濃度為O. 1-100 μ g/mL，特別優選的，本發明所述的試劑盒中補體Clq濃度為
O.1-0. 4 μg/mL。
[0015]本發明所述的酶標記的抗補體用于與補體結合，同時酶標記的抗補體與顯色液作用，最終實現定量檢測。本發明所述的酶標記的抗補體優選為酶標記的抗補體Clq，更優選的，本發明所述的酶標記的抗補體Clq可以為辣根過氧化物酶標記的抗補體Clq，最優選的，本發明所述的辣根過氧化物酶標記的抗補體Clq濃度為O. 1-100 μ g/mL,最優選的，本發明所述的辣根過氧化物酶標記的抗補體Clq濃度為O. 5-10 μ g/mL,特別優選的，本發明所述的試劑盒中辣根過氧化物酶標記的抗補體Clq濃度為O. 625-2. 5 μ g/mL。
[0016]優選的，本發明所述的顯色液可以為現有技術中任何與酶標記的抗補體中的酶作用后顯色的物質。更優選的，本發明所述的顯色液為TMB顯色液。
[0017]在本發明的【具體實施方式】中，所述的血型抗原可以采用合成方法或血液提取法獲得。在本發明的【具體實施方式】中，固定有血型抗原的固相載體的制備方法，包括:將固相載體的表面氨基化或醛基化；用6°Co輻照固相載體或用紫外線照射固相載體；將血型抗原或含血型抗原的紅細胞膜蛋白提取物用碳酸鹽緩沖液稀釋，以50-500 μ L包被固相載體，放置l_36h后去除液體，加入含5-20%牛血清白蛋白BSA的磷酸鹽緩沖液，在室溫下封閉l_8h，甩去液體，干燥即得。優選的，所述的固相載體的表面氨基化采用多聚賴氨酸進行表面氨基化，更優選的，所述的固相載體的表面氨基化包括加入50-500 μ L的濃度為0.05-lg/L的多聚賴氨酸，水浴l-10h，除去液體后以蒸餾水洗滌，最優選的，所述的固相載體的表面氨基化包括加入100-200 μ L的濃度為0.05-0.2g/L的多聚賴氨酸，水浴2_4h，除去