一種葡聚糖的夾心酶聯免疫吸附測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及葡聚糖，特別是涉及一種葡聚糖的夾心酶聯免疫吸附測定方法。
【背景技術】
[0002] 葡聚糖，又名右旋糖酐，由數個葡萄糖分子聚合而成，具有較高的分子量，葡萄糖 殘基之間主要以α-1，6鍵連接，支鏈主要有1，2鍵，1，3鍵，1，4鍵等。葡聚糖可由蔗糖溶 液中污染的細菌的葡聚糖蔗糖酶催化下產生：蔗糖一葡聚糖+果糖。葡聚糖從結構上可以 分為α型和β型：前者常見于細菌分解蔗糖產生，后者具有生理活性，存在于真菌細胞壁 中。（1.范瑞梅，范家恒.葡聚糖的免疫作用及研究進展.甘蔗糖業，2006,（6) :38-41)
[0003] 近年來，由于葡聚糖在醫學和食品工業上的應用不斷增多，有關葡聚糖的檢測也 引起了人們的關注，針對葡聚糖含量的檢測在方法上有了很大的發展，已經建立起了多種 檢測方法，但是由于免疫學方法自身的諸多優點，使其很快在葡聚糖的檢測上得到了重視。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供具有特異性強、靈敏度高、快速簡便、易于操作、對儀器的要 求低等優點，可用于對不同樣品中的葡聚糖進行定量檢測的一種葡聚糖的夾心酶聯免疫吸 附測定方法。
[0005] 本發明包括以下步驟：
[0006] 1)酶標反應板的包被，具體方法為：取葡聚糖單克隆抗體雜交瘤細胞株D9包被96 孔酶標板，100 μ L/孔，同時設置陰性對照孔和空白孔，4°C過夜；
[0007] 2)酶標反應板的封閉，具體方法為：用洗滌液洗滌酶標板，拍干，加封閉液，37°C 孵育；
[0008] 3)加檢測樣品，具體方法為：用洗滌液洗滌酶標板，拍干，加入Dextran 2000標準 品或樣品溶液，100 μ L/孔，同時設標準品零值孔、陰性孔，每個樣品設3個復孔，37°C反應；
[0009] 4)加酶標二抗，具體方法為：用洗滌液洗滌酶標板，拍干，加入D24酶標抗體，37°C 溫育；
[0010] 5)加底物顯色，具體方法為：用洗滌液洗滌酶標板，拍干，加入顯色(PD溶液，37°C 溫育；
[0011] 6)終止反應，具體方法為：每孔加入50 μ L氏304溶液終止反應；
[0012] 7)0D值的測定，具體方法為：用酶標儀測定，以空白孔調零，在Α490波長測定樣品 和陰性對照的OD值，完成葡聚糖的夾心酶聯免疫吸附測定。
[0013] 在步驟1)中，所述葡聚糖的質量濃度可為2. 5 μ g/mL，所述雜交瘤細胞株D9已 于2010年12月07日保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學，郵編： 430072,保藏中心保藏編號為CCTCC NO :C2010107 ;所述包被的包被液可采用摩爾濃度為 0· lmol/L的碳酸鹽緩沖液，pH 9. 6〇
[0014] 在步驟2)中，所述洗滌劑可采用pH 7. 2的PBST，所述洗滌的次數可為5次，每次 洗滌的時間可為90s ;所述封閉液可采用IOmM的PBS溶液，含2% BSA ;所述封閉液的加入 量可為每孔加封閉液200 μ L ;所述孵育的時間可為2h。
[0015] 在步驟3)中，所述洗滌劑可采用PBST，所述洗滌的次數可為5次，每次洗滌的時間 可為90s ;所述反應的時間可為lh。
[0016] 在步驟4)中，所述洗滌劑可采用PBST，所述洗滌的次數可為5次，每次洗滌的時間 可為90s ;所述D24酶標抗體可采用1 : 8000的D24酶標抗體，1 : 8000的D24酶標抗體 可通過改良的高碘酸氧化法制備；加入D24酶標抗體的量可為100 μ L/孔；所述溫育的時 間可為45min。
[0017] 在步驟5)中，所述洗滌劑可采用PBST，所述洗滌的次數可為5次，每次洗滌的時間 可為90s ;所述加入顯色(PD溶液的量可為50 μ L/孔；所述溫育的時間可為lOmin。
[0018] 在步驟6)中，所述H2SO4溶液的摩爾濃度可為2mol/L。
[0019] 本發明基于抗葡聚糖單克隆抗體建立的夾心酶聯免疫吸附測定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法，可定量檢測樣本中的葡聚糖，具有特異性強、靈敏度 高、快速簡便易于操作、對儀器的要求低等優點，更能適應大規模樣品檢測的需要。
【附圖說明】
[0020] 圖1為抗體純化SDS-PAGE電泳鑒定。
[0021 ] 圖2為酶標抗體效價測定。
[0022] 圖3為不同株抗體ELISA實驗。
[0023] 圖4為抗體與酶標抗體棋盤滴定實驗。
[0024] 圖5為ELISA標準曲線及線性范圍。
[0025] 圖6為抗體穩定性比較。
[0026] 圖7為抗體特異性鑒定。
【具體實施方式】
[0027] 下面結合實施例對本發明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發明的較佳實施 例而已，并非對本發明做其他形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示 的技術內容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發明方案內容，依據本發明 的技術實質對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發明的保護范圍內。
[0028] 實施例1 :葡聚糖雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立
[0029] 1、材料
[0030] I. 1抗葡聚糖單克隆抗體
[0031] 抗葡聚糖單克隆抗體D9為高效的雜交瘤細胞分泌的，制備方法見第2. 2節。
[0032] 1. 2主要試劑及儀器
[0033] Dextran 標準品 Pharmacia 公司；rProtein A 填料 Sepharose?;辣根過氧化物酶 (HRP)購自Sigma公司；BSA，OVA購自Sigma公司；OPD購自Sigma公司，高碘酸鈉購自上海 生工；硼氫化鈉購自上海生工；包被板條購自JET公司；BSA購自Sigma公司；其它常規化學 試劑均為國產分析純試劑。
[0034] 2、方法
[0035] 2. 1葡聚糖檢測試劑標準品配制
[0036] 稱取 Ig Dextran 2000,用磷酸鹽緩沖液（ρΗ7· 2,0· 01mol/L PBS)稀釋到 1000mL， 得到濃度為1000 μ g/mL的母液，再按實驗要求用PBS將母液稀釋得到各種濃度。
[0037] 2. 2抗體的制備與純化鑒定
[0038] 采用腹水法制備抗體。石蠟油注射到小鼠腹腔，0. 5mL/只，1~2周后每只小鼠腹 腔注射2 X IO6個雜交瘤細胞，注射細胞10~15d后，收集小鼠腹水，3000r/min離心10min， 棄油脂，收集中間澄清腹水，備用。采用親和層析法純化抗體，依照rProtein A試劑說明書 進行純化，Lowry法檢測抗體蛋白濃度，SDS-PAGE電泳鑒定抗體的純度，間接ELISA測定抗 體效價。選擇效價最高的抗體進行酶標。
[0039] 2. 3抗體的酶標與效價測定
[0040] 采用高碘酸氧化法標酶，步驟如下：
[0041] (1)稱取5mg HRP溶解于ImL蒸餾水中；
[0042] (2)加入0· 2mL新配的0· IM NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20min ;
[0043] (3)將上述溶液裝入透析袋中，對ImM ρΗ4· 4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜；
[0044] (4)加0· 2M ρΗ9· 6碳酸鹽緩沖液，使醛化的HRP的pH升高到9. 0~9. 6,然后立 即加入IOmg葡聚糖抗體，室溫避光輕輕攪拌2h ;
[0045] (5)加 0· ImL 新配的 4mg/mL 似8!14液，混勻，置 4°C 2h ;
[0046] (6)將上述液裝入透析袋中，對0· 15M ρΗ7· 4PBS透析，4°C過夜；
[0047] (7)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C Ih ;
[0048] (8) 3000rpm離心30min，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于 少量 0· 15M ρΗ7· 4 的 PBS 中；
[0049] (9)將上述溶液裝入透析袋中，對0· 15Μ ρΗ7· 4的PBS緩沖液透析，換液4~6次， 10, OOOrpm離心30min取上清液，加等量甘油，分裝，-20°c保存；
[0050] (10)以Dextran 40-0VA為包被抗原，直接ELISA法檢測酶標抗體的效價。
[0051] 2. 4捕獲抗體的確定
[0052] 將純化的抗體按5 μ g/mL分別包被微孔板，每孔100 μ L，4°C，過夜；加入1 μ g/ mL的Dextran 2000標準品100 yL/孔，37°C反應Ih ;加入倍比稀釋的葡聚糖酶標抗體 100 μ L/孔，PBST洗板。OPD顯色，H2SO4終止，酶聯檢測儀測OD 49Qnni值。依據反應曲線和P/ N值（陽性與陰性OD值比值），確定最佳檢測抗體。
[0053] 2. 5捕獲抗體包被濃度和酶標抗體工作濃度的確定
[0054] 采用棋盤滴定法，方法如下：
[0055] (1)分別將抗體于濃度為 1