一種食品中3-硝基丙酸高效液相色譜分析檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于食品安全技術領域，具體涉及食品中3-硝基丙酸的檢測方法。 二、 技術背景
[0002] 3-硝基丙酸為白色結晶化合物，易溶于水、甲醇、乙酸乙酯、乙腈等極性溶劑。研究 表明，3-硝基丙酸是曲霉屬和青霉屬少數菌種的代謝產物，我國從變質甘蔗中分離所得的 甘蔗節菱孢、蔗生節菱孢霉菌等菌種也能產生3-硝基丙酸。3-硝基丙酸是一種神經毒素， 人誤食容易發生中毒，兒童中毒尤為嚴重，該中毒癥的主要表現為中樞神經系統受損。急 性期的癥狀有嘔吐、眩暈、陣發性抽搐、眼球偏側凝視、昏迷，甚至死亡，后遺癥主要為錐體 外系的損害，主要癥狀有屈曲、扭轉、痙攣，肢體強直，靜止時張力減低等。人中毒劑量約為 12.5mg/kg〇 〇
[0003] 甘蔗作為一種富含糖分的農作物，深受大眾喜愛，其深加工制品（比如蔗糖）也廣 泛存在人們日常生活中。在我國，甘蔗的主產區是廣西、福建、廣東、海南等南方地區，北方 地區則需從南方調運。在運輸、存儲過程中，新鮮甘蔗容易發霉變質。相關研究表明，變質 發紅的甘蔗中含有3-硝基丙酸，以變質甘蔗作為原料生產的食品也可能受到3-硝基丙酸 的污染，尤其蔗糖，在食品中用途尤為廣泛，對食品安全造成較大的威脅。用米曲霉發酵產 生的酶制劑可能含有強毒物質3-硝基丙酸，聯合圍糧農組織和世界衛生組織關于食品添 加劑的聯合專家委員會（Joint FA0/WH0 Expert Committeeon Food Additives)在 1987 即明確規定用米曲霉發酵生產的淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖化酶、脂肪酶等時均要檢測3-NPA。 原料中含有這些物質的食品也可能受到3-硝基丙酸的污染。
[0004] 目前，對于3-硝基丙酸的檢測研究則多集中于甘蔗和霉菌中的含量，比如固相萃 取-超高效液相色譜串聯質譜法檢測甘蔗中3-硝基丙酸的方法研究（李兵等中國食品衛 生雜志2012年第24卷第2期），采用乙腈提取，氨基柱凈化，液質聯用進行檢測分析。3-硝 基丙酸的液相色譜分析（江濤等衛生研究1999年05期），該方法利用反相高效液相色譜 法定量分析米曲霉菌種培養基中3-硝基丙酸的含量，樣品用乙酸乙酯提取。固相萃取/超 高效液相色譜-電噴霧串聯質譜法檢測酶制劑中3-硝基丙酸（張璐分析測試學報第32 卷第6期），該法采取乙腈提取，PSA固相萃取柱凈化，液質聯用進行檢測分析。
[0005] 這些方法多針對特定基質，提取和凈化方式不能滿足檢測各類食品的需求。比如 文獻中采用乙腈提取、具有弱陰離子交換功能的氨基柱、PSA柱凈化，這種方法對于鹽分含 量高的樣品就不適合，由于各種離子的干擾，造成同收率很低。直接采用乙酸乙酯等非極性 溶劑提取，對于一些固體、半固體樣品滲透能力差，提取效果不好，并且容易被油脂等非極 性成分干擾。
[0006] 本法通過優化提取方式，最后采用pH 8. 0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液均質提取， 調節PH值至2. 0后，乙酸乙酯萃取磷酸鹽緩沖溶液中的3-硝基丙酸。提取效率高，采用緩 沖鹽提取不易被樣品基質干擾，并且通過液液萃取有效的去除了多數水溶性雜質。
[0007] 然后進一步優化了凈化方式，通過比較各種凈化方式，發現各種固相萃取柱（比 如中性氧化鋁等）凈化效果和回收率都不太理想。考慮采用GPC，3-硝基丙酸分子量119， 不在多數GPC凈化柱的適宜分子量范圍內，通過比較篩選，最后發現Bio-Rad Bio-Beads S-X3, 200-400目填料盡管適宜分子量范圍400-14000,但對于3-硝基丙酸的凈化效果良 好。
[0008] 本法簡單快速，提取效率高，雜質去除效果好，對各類食品檢測都沒有干擾，提供 了一個較好的食品中3-硝基丙酸的檢測方法。 三、
【發明內容】
[0009] 本發明所要解決的技術問題是適用于各類食品中3-硝基丙酸的檢測方法，能夠 有效的提取各類食品中的3-硝基丙酸，并很好的去除各類食品中的干擾物。
[0010] 本發明的技術方案是通過以下步驟實現的：
[0011] (1)提取：稱取樣品5. 0g(精確到0· OOOlg)于50ml離心管中，加入40ml pH 8. 0 的Na2HPO4-NaH2POgl沖溶液，均質提取lOmin，高速冷凍離心后，移取緩沖鹽溶液，40ml pH 8. O的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶重復提取一次，合并提取液，用磷酸調節pH至2. 0,分別用 30ml、30ml乙酸乙酯萃取兩次，合并乙酸乙酯層，待GPC凈化。
[0012] ⑵凈化：
[0013] 凝膠滲透色譜條件：
[0014] 凈化柱：Bi〇-Rad Bio-Beads S-X3, 200-400 目；
[0015] 檢測波長：254nm ;
[0016] 流動相：乙酸乙酯+正己烷（體積比I : 1);
[0017] 進樣量：5ml;
[0018] 開始收集時間：l〇min ;
[0019] 結束收集時間：25min ;
[0020] 50°C氮吹至干，準確移取0. 5ml流動相溶解殘渣，混勻后，過0. 45 μ m濾膜，待測。
[0021] (3)高效液相色譜-二極管陣列檢測器檢測。
[0022] 色譜柱：Agilent HC-C18 (4. 6 X 250mm，5 μ m);
[0023] 流動相：乙腈+0· 02mol/L KH2PO4溶液=10% +90% ;
[0024] 柱溫：4(TC ;
[0025] 流速：1.0 ml/min ;
[0026] 檢測波長：2IOnm ;
[0027] 進樣體積：20 μ L。
[0028] 本發明所述檢測方法前處理步騾簡單新穎，除雜效果好，方法的靈敏度、回收率 高，測定結果的精密度好，檢出限為10 μ g/kg。
[0029] 具體實施方法
[0030] 本發明將通過以下實施例作進一步說明。實施例僅用于說明本發明而不用于限制 本發明的范圍。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可用于本發明中，文中 所述的較佳實施方法僅作示范之用。
[0031] 實施例1
[0032] I、儀器與試劑
[0033] 高效液相色譜儀：日本島津LC-20AT，配二極管陣列檢測器；
[0034] 標準物質：3_硝基丙酸，純度98. 0% ;
[0035] 乙腈：色譜純；
[0036] 乙酸乙酯、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸均為分析純；
[0037] 本方法中所用水均為一級水。
[0038] 2、儀器分析條件
[0039] 凝膠滲透色譜條件：
[0040] 凈化柱：Bi〇-Rad Bio-Beads S-X3, 200-400 目；
[0041] 檢測波長：254nm;
[0042] 流動相：乙酸乙酯+正己烷（體積比I : 1);
[0043] 進樣量：5ml ;
[0044] 開始收集時間：IOmin ;
[0045] 結束收集時間：25min ;
[0046] 液相色譜條件：
[0047] 色譜柱：Agilent HC-C18 (4. 6 X 250mm，5 μ m);
[0048] 流動相：乙腈+0· 02mol/L KH2PO4溶液=10% +90% ;
[0049] 柱溫：4(TC ;
[0050] 流速：1.0 ml/min ;
[0051] 檢測波長：2IOnm;
[0052] 進樣體積：20 μ L。
[0053] 3、線性方程及標準品色譜圖
[0054] 標準儲備液配制：稱取10. 5mg 3-硝基丙酸標準物質，用乙腈溶解并定容至 100m