一種基于石墨烯衍生物的葡萄糖氧化酶電極及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于電化學分析檢測技術領域，具體涉及一種基于石墨烯衍生物的葡萄糖氧化酶電極及其制備方法。
【背景技術】
[0002]糖尿病是一種由于胰島素缺乏所致的以高血糖為特征的代謝性疾病，是導致死亡和傷殘的原因之一。診斷和控制糖尿病需要隨時監測血液中的葡萄糖水平，因此成千上萬的糖尿病患者需每天檢測血糖。如何進行可靠、密切地血糖控制仍I日是一個值得研究的課題。其中，在血糖監測中，葡萄糖電化學生物傳感器起著重要的作用，而以電極上固定葡萄糖氧化酶為基礎的電流型酶電極被廣泛應用于葡萄糖電化學生物傳感器的研究中。
[0003]近年來葡萄糖檢測已經從人工肉眼觀察化學反應的階段逐步發展為自動化設備監測，運用電化學反應測定血糖，快速靈敏，已經成為研究和應用的一大趨勢。葡萄糖氧化酶檢測葡萄糖具有極高特異性，將葡萄糖氧化酶固定在電極表面，運用電化學方法將生物化學反應信號轉化為電信號，能夠提高檢測的靈敏度及準確度。現有的葡萄糖氧化酶電極在酶的固定、重復利用及檢測靈敏度方面有待改進。Juan Tian等人直接利用氧化石墨烯構建電極來進行信號放大，然而氧化石墨烯在水中溶解度較高，在水體系檢測中，電極的重復利用度低，此外氧化石墨稀的導電性較差(Tian J, Yuan P X，Shan D, et al.B1sensingplatform based on graphene oxide via self-assembly induced by synergicinteract1ns[J].Analytical b1chemistry, 2014，460:16-21.)0
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種制備方法簡便、檢測限低、靈敏度高、酶結合強度高的基于石墨烯衍生物的葡萄糖氧化酶電極及其制備方法。
[0005]為了達到上述目的，本發明提供了一種基于石墨烯衍生物的葡萄糖氧化酶電極，該電極依次由導電電極基底、石墨烯衍生物/多巴胺復合層、聚多巴胺層、納米金陣列、4-巰基苯硼酸(MPBA)層、和葡萄糖氧化酶層組成，所述的石墨烯衍生物/多巴胺復合層為多巴胺與氧化石墨烯混合后，多巴胺與部分氧化石墨烯發生氧化還原反應后的混合物。
[0006]所述導電電極基底選自碳基電極基底、導電金屬電極基底或半導體電極基底。
[0007]本發明的葡萄糖氧化酶電極運用納米材料層層放大信號，降低檢測限，提高了檢測靈敏度；在氧化石墨烯的基礎上引入還原型氧化石墨烯，提高了疏水性且增強了電極的導電性；利用MPBA —端的巰基與納米金結合，同時另一端的羥基捕捉葡萄糖氧化酶，在不影響靈敏度的情況下顯著提高了結合強度。
[0008]本發明還提供上述葡萄糖氧化酶電極的制備方法，具體步驟如下:首先將等質量的鹽酸多巴胺和氧化石墨烯溶于PH值為8.5的Tris-HCl緩沖液中，分散均勻后反應，然后離心清洗、干燥即得石墨烯衍生物/多巴胺復合物，再將復合物溶解制備成石墨烯衍生物/多巴胺復合物溶液，并采用石墨烯衍生物/多巴胺復合物溶液修飾導電電極基底，之后采用電化學法在電極表面電聚合多巴胺，再依次采用納米金溶液和4-巰基苯硼酸溶液修飾電極，最后用葡萄糖氧化酶溶液修飾電極，即得所述的葡萄糖氧化酶電極。
[0009]所述的電化學法為以石墨烯衍生物/多巴胺復合物溶液修飾過的導電電極基底為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑電極為對電極，濃度為4mM、pH值為7.5的多巴胺磷酸緩沖溶液為電解液，利用電化學工作站的循環伏安掃描，在工作電極表面電聚合多巴胺。
[0010]所述的石墨烯衍生物/多巴胺復合物溶液的濃度為0.5?3mg/mL，4-巰基苯硼酸的濃度為I?10mM，葡萄糖氧化酶的濃度為10?12mg/mL。
[0011 ] 進一步地，所述的石墨烯衍生物/多巴胺復合物溶液的濃度優選為I?2mg/mL。
[0012]進一步地，4-巰基苯硼酸的濃度優選為5?8mM。
[0013]本發明與現有技術相比，其顯著優點是:(1)電極制備過程簡單快速；(2)該體系用多層納米材料對信號進行層層放大，得到的葡萄糖氧化酶電極對葡萄糖有高檢測靈敏度及寬線性檢測范圍，檢測速度快；(3)利用還原型氧化石墨烯，提高了疏水性且增強了電極的導電性，利于電極的重復利用；(4)MPBA分別與納米金及葡萄糖氧化酶穩固結合，在不影響靈敏度的情況下顯著提高了結合強度，具有良好的穩定性。
【附圖說明】
[0014]圖1為本發明的基于石墨烯衍生物的葡萄糖氧化酶電極的構建過程示意圖。
[0015]圖2為實施例1制備得到的納米金的紫外光譜表征圖。
[0016]圖3為實施例5中葡萄糖氧化酶電極檢測葡萄糖的時間-響應電流曲線，內插圖為900-1300秒的時間-響應電流放大圖。
[0017]圖4為實施例5中葡萄糖氧化酶電極檢測葡萄糖的濃度-響應電流曲線，內插圖為葡萄糖濃度-電流校正曲線。
【具體實施方式】
[0018]下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步詳細說明。
[0019]基于石墨烯衍生物的葡萄糖氧化酶電極的制備方法，具體步驟如下:
[0020]步驟1、基底電極拋光、清洗后吹干；
[0021]步驟2、將等質量的鹽酸多巴胺和氧化石墨烯溶于pH 8.5的Tris-HCl緩沖液中，分散均勻后攪拌反應然后離心清洗，干燥即得石墨烯衍生物/多巴胺復合物，之后將復合物溶解制備濃度為0.5?3mg/mL的石墨烯衍生物/多巴胺復合物溶液；
[0022]步驟3、將步驟2得到的石墨烯衍生物/多巴胺復合物溶液滴涂在處理過的導電電極基底；
[0023]步驟4、以步驟3得到的電極為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑電極為對電極，濃度為4mM、pH值為7.5的多巴胺磷酸緩沖溶液為電解液，利用電化學工作站的循環伏安掃描，在工作電極表面電聚合多巴胺；
[0024]步驟5、根據Frens法制備納米金，將質量分數為I %檸檬酸鈉溶液加入到質量分數為1%四氯金酸溶液中，加熱煮沸，直至溶液呈酒紅色，冷卻即得納米金溶液；
[0025]步驟6、將步驟5得到的納米金滴涂在步驟4得到的電極，自組裝40min，納米金與多巴胺有序結合；
[0026]步驟7、將I?1mM的MPBA溶液滴涂在步驟6得到的電極，室溫2h，沖洗干燥；
[0027]步驟8、將5?15mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液滴涂在步驟7得到的電極，即得葡萄糖氧化酶電極。
[0028]實施例1
[0029]步驟1、將鉑電極分別用粒徑為0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3懸濁液在麂皮拋光成鏡面，再依次用無水乙醇和超純水各超聲2min，置于干燥器內干燥備用；
[0030]步驟2、將30mg鹽酸多巴胺溶于PH = 8.5Tris_HCl溶液中，然后加入等質量的氧化石墨烯，超聲分散均勻，攪拌反應4h后，于14000rpm、4°C離心30min，去上清液，二次蒸餾水離心清洗三次，之后將沉淀烘干，二次蒸餾水溶解復合物，超聲至均勻分散制備0.5mg/mL的石墨烯衍生物/多巴胺復合物溶液；
[0031 ] 步驟3、滴加1yL步驟2得到的石墨烯衍生物/多巴胺復合物溶液在處理過的鉑電極上；
[0032]步驟4、以步驟3得到的電極為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑電極為對電極，濃度為4mM、pH值為7.5的多巴胺磷酸緩沖溶液為電解液，利用電化學工作站的循環伏安掃描，在工作電極表面電聚合多巴胺，掃描電壓為-0.6?0.6V，掃描速度為50mV/s，掃描段數為20 ;
[0033]步驟5、納米金的制備方法根據Frens法進行改進，錐形瓶經王水處理后，加入10mL沸騰的二次蒸餾水，隨后加入ImL I %四氯金酸溶液，劇烈攪拌，立即順漩渦方向加入2.5mLl %梓檬酸鈉溶液，溶液由無色變為藍色變為酒紅色后，持續沸騰lOmin，然后停止加熱攪拌冷卻至室溫即得納米金溶液；
[0034]步驟6、滴加10 μ L的步驟5得到的納米金溶液在步驟4得到的電極上，自組裝40min，納米金與多巴胺有序結合；
[0035]步驟7、滴加10 μ L的ImM的MPBA溶液在步驟6得到的電極上，室溫靜置2h后沖洗干燥；
[0036]步驟8、滴加10 μ L的5mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液在步驟7得到的電極上，室溫靜置6h，即得葡萄糖氧化酶電極。
[0037]步驟2用Frens法制備得到的新鮮納米金膠體用二次蒸餾水稀釋10倍后用紫外-可見光譜儀檢測，結果如圖2所示。從圖中可知，523nm處為最大吸收峰，由膠體金顆粒粒徑與最大吸收峰之間的回歸曲線方程Y = 0.786X+505.53可計算得到制備的納米金顆粒直徑大約為22nm。制備得到的納米金顏色為酒紅色，尺寸分布均勻，未發生團聚現象。
[0038]實施例2
[0039]步驟1、將鉑電極分別用粒徑為0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3懸濁液在麂皮拋光成鏡面，再依次用無水乙醇和超純水各超聲2min，置于干燥器內干燥備用；
[0040]步驟2、將30mg鹽酸多巴胺溶于PH = 8.5Tris_HCl溶液中，然后加入等質量的氧化石墨稀，超聲分散均勾，攪拌反應4h后，于14000rpm、4°C離心30min，去上清液，二次蒸餾水離心清洗三次，之后將沉淀烘干，二次蒸餾水溶解復合物，超聲至均勻分散制備lmg/mL的石墨烯衍生物/多巴胺復合物溶液；
[0041 ] 步驟3、滴加1yL步驟2得到的