石墨烯/酶電化學生物傳感器的制備及對有機磷農藥殘留的檢測的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種石墨烯/酶電化學生物傳感器及其制備方法，該電化學生物傳感 器可應用于有機磷農藥的檢測，具有靈敏度高，制備簡單，操作方便等優點。
【背景技術】
[0002] 有機磷農藥（organophosphorus pesticide, OPs)是一類高效、廣譜的殺蟲劑、除 草劑，因其高的殺蟲活性，在農業領域中被廣泛使用。然而，有機磷農藥的不當使用導致其 大量殘留，對環境和人類健康造成巨大威脅。有機磷農藥中毒主要是OPs能抑制乙酰膽堿 酯酶（AChE)的活性，使乙酰膽堿（acetycholine，ATCl)過量積聚，引起中樞神經調節功能 紊亂，導致呼吸系統破壞及死亡。因此，發展快速、靈敏、高效的超微農藥檢測的檢測方法是 具有重要意義的。
[0003] 檢測有機磷農藥的傳統分析方法，如分光光度法、滴定法、氣相色譜法、液相色譜 法、化學發光等已被廣泛應用，雖然這些方法對農藥殘留的檢測較為靈敏、可靠，但是存在 儀器價格昂貴、檢測耗時長、不適合現場檢測、需要復雜的預處理步驟等缺點，為有機磷農 藥的檢測帶來了不便之處。而石墨烯/酶電化學生物傳感器則是通過改變酶的活性，對有 機磷農藥進行檢測的。由于石墨烯/酶電化學生物傳感器具有檢測快速、操作簡單、成本 低、靈敏度高等優點，所以，石墨烯/酶電化學生物傳感器應用于有機磷農藥的檢測，可為 有機磷農藥的檢測帶來方便。
[0004] 電極的表面修飾是構建電化學生物傳感器至關重要的環節。目前修飾電極的材料 主要有碳納米管、C60、納米金、納米二氧化鈦等，其中石墨烯由于具有獨特的電學性質和催 化性能，受到了廣泛應用。氧化石墨稀（Graphite oxide)是石墨稀重要的派生物，它的結 構與石墨烯大體相同，但是氧化石墨表面含有大量功能性基團，如羥基、羧基、環氧基和羰 基等，這些含氧官能團的存在使得氧化石墨烯的片層與片層之間擺脫了強大的JT-JT范德 華吸引力，彼此分開。另外，由于大量親水基團的存在，氧化石墨具有較好的親水性，這也使 得氧化石墨能以單片的形式分散在水溶液中，形成穩定的膠體溶液。因此，制備的氧化石墨 烯既有功能基團的性質，又保有一定的導電能力。所以在制備檢測有機磷農藥的電化學生 物傳感器的過程中，氧化石墨稀是一個首選納米材料。然而，在適合固定AChE的中性和堿 性溶液中，氧化石墨烯并不穩定。因此需要尋找一種載體，使氧化石墨烯在中性和堿性溶液 中，變得穩定。殼聚糖是天然產物，且具有良好的生物相容性、無毒性及高機械強度并且價 格便宜等優點，所以被廣泛選擇作為固定載體。最近的研究表明，氧化石墨與殼聚糖同時在 電極表面存放形成的復合膜在中性溶液和堿性溶液中具有良好的生物相容性和穩定性。
[0005] 在本發明中，申請人通過改進hu_ers法制備氧化石墨稀，然后將氧化石墨稀 (GO)-殼聚糖（CS)混合溶液修飾在玻碳電極（GCE)表面，再將乙酰膽堿酯酶（AChE)修 飾到有GO-CS混合膜的GCE表面，形成氧化石墨烯-殼聚糖-乙酰膽堿酯酶/玻碳電極 (G〇-CS-AChE/GCE)，構建了檢測有機磷農藥的石墨烯/酶電化學生物傳感器，同時還檢測 了該石墨烯/酶電化學生物傳感器對有機磷農藥檢測的靈敏度。
【發明內容】
[0006] 本發明是鑒于現有技術中存在的上述問題而做出的，本發明的目的在于提供一種 制備簡單、成本低、穩定性高、能快速靈敏檢測有機磷農藥的石墨稀/酶電化學生物傳感 器。本發明還提供了該石墨烯/酶電化學生物傳感器的制備方法及其用途。
[0007] 具體地，本發明以玻碳電極作為基底電極，在其表面修飾了氧化石墨烯（GO)-殼 聚糖（CS)混合膜，然后將AChE固定在GO-CS混合膜修飾的玻碳電極表面，構建了用于檢測 有機磷農藥的電化學生物傳感器。GO-CS復合膜具有氧化石墨特殊的電子傳輸性質和大的 比表面積，同時，其能保持殼聚糖良好的生物相容性和AChE的活性，當GO-CS復合膜作為載 體對有機磷農藥進行檢測時，既能保持生物傳感器的穩定性，又能提高檢測的靈敏度。進一 步地，所述有機磷農藥選自西維因和敵百蟲，也可用于其他有機磷農藥的檢測
[0008] 更具體地，通過改進的Hmnmers法制備氧化石墨稀（GO)，隨后將氧化石墨稀與殼 聚糖溶液混合制成氧化石墨烯（GO)-殼聚糖（CS)混合溶液，在玻碳電極表面上依次滴加 GO-CS混合溶液和乙酰膽堿酯酶，從而獲得乙酰膽堿酯酶-氧化石墨烯-殼聚糖修飾的玻碳 電極（G〇-CS-AChE/GCE)生物傳感器。進一步地，所述殼聚糖溶液的濃度為0. 05% -0. 4%， 優選為〇. 2%。所述乙酰膽堿酯酶的濃度為0. 2-2. Ommol/1，優選為1.0 mmol/1。
[0009] 根據本發明的另一實施方案，提供了使用G〇-CS-AChE/GCE檢測有機磷農藥如西 維因和敵百蟲的方法，所述方法包括將G〇-CS-AChE/GCE浸入不同濃度西維因和敵百蟲的 標準溶液5min后，采用循環伏安曲線法，進行電化學檢測，通過建立不同濃度的敵百蟲和 西維因標準曲線，計算出其檢出限。結果表明構建的酶生物傳感器應用于西維因和敵百 蟲的檢測時，它們的線性范圍分別為10~lOOnmol/L和10~60nmol/L，相關系數分別為 0. 993和0. 994,經計算可知檢出限均為3. 3nmol/L(檢出限為最低檢測濃度的三分之一）。 進一步地，西維因和敵百蟲標準溶液的濃度為10~100nmol/L。
[0010] 本發明的有益效果
[0011] 由此可知，本發明的方法操作簡單，檢測快速，并且靈敏度高，彌補了傳統光譜法 和色譜法的樣品處理繁瑣、儀器價格昂貴等不足。此外，還將本發明制備的生物傳感器應用 于生菜樣品的檢測，并對酶的穩定性進行了檢測。這些結果均表明，本發明的生物傳感器具 有優異的穩定性，高的靈敏度等優點，適用于有機磷農藥的快速、靈敏檢測。
【附圖說明】
[0012] 圖1為制備本發明的乙酰膽堿酯酶-氧化石墨烯-殼聚糖修飾的玻碳電極 (G〇-CS-AChE/GCE)生物傳感器的實驗流程圖。
[0013] 圖2(a)為氧化石墨烯（GO)的掃描電子顯微鏡（SEM)圖。
[0014] 圖2 (b)為氧化石墨稀（GO)的原子力顯微鏡（AFM) 〇
[0015] 圖2 (c)為氧化石墨烯（GO)的X射線衍射（XRD)譜圖。
[0016] 圖2(d)為氧化石墨烯（GO)的透射電子顯微鏡（TEM)圖。
[0017] 圖2(e)為氧化石墨烯（GO)的高分辨透視電子顯微鏡（HRTEM)和選區電子衍射 (SAED)圖。
[0018] 圖 3 為 GCE、GO_CS/GCE、AChE/GCE 和 G〇-CS-AChE/GCE 在 0· lmol/LPBS (c (ATCl)= 1.0 mmol，pH = 7. 0)中的循環伏安曲線圖；掃描速率：100mV/s。
[0019] 圖 4 (a)為 G〇-CS-AChE/GCE 在 0· lmol/LPBS (pH = 7. 0)隨著 ATCl 濃度變化的循 環伏安圖，ATCl的濃度從0. 2mmol/L到2. 0mmol/L，掃描速率：100mV/s。
[0020] 圖 4 (b)為 G〇-CS-AChE/GCE 在 0· lmol/LPBS (pH = 7. 0)隨著 ATCl 濃度變化的峰 電流圖，ATCl的濃度變化從0. 2mmol/L到2. 0mmol/L。
[0021] 圖 5 (a)為 G〇-CS-AChE/GCE 在 0· lmol/LPBS (c (ATCl) = 1.0 mmol，pH = 7. 0)中對 不同濃度西維因的循環伏安響應曲線，掃描速率：l〇〇mV/s。
[0022] 圖5(b)為G〇-CS-AChE/GCE對不同濃度西維因的峰電流標準曲線，標準工作曲線 為 10nmol/L ~100nmol/L，支持電解質為 0· lmol/LPBS (c (ATCl) = 1.0 mmol，pH = 7. 0)。
[0023] 圖5(c)為G〇-CS-AChE/GCE對不同濃度西維因的抑制率曲線，標準工作曲線為 10nmol/L ~100nmol/L·，支持電解質為 0· lmol/LPBS (c (ATCl) = 1.0 mmol，pH = 7. 0)。
[0024] 圖 6 (a)為 G〇-CS-AChE/GCE 在 0· lmol/LPBS (c (ATCl) = 1.0 mmol，pH = 7. 0)中對 不同濃度敵百蟲的循環伏安響應曲線，其中敵百蟲濃度為lOnmol/L~100nmol/L，掃描速 率：100mV/s 〇
[0025] 圖6(b)為G〇-CS-AChE/GCE對不同濃度西維因的峰電流標準曲線，標準工作曲線 為 10nmol/L ~60nmol/L，支持電解質為 0· lmol/LPBS (c (ATCl) = 1.0 mmol，pH = 7. 0)。
[0026] 圖6(c)為G〇-CS-AChE/GCE對不同濃度西維因的抑制率曲線，標準工作曲線為 10nmol/L ~60nmol/L.，支持電解質為 0· lmol/LPBS (c (ATCl) = 1.0 mmol，pH = 7. 0)。
[0027] 圖 7 為 G〇-CS-AChE/GCE 在 0· lmol/LPBS (c (ATCl) = 1.0 mmol，pH = 7. 0)中對生 菜樣品的循環伏安響應曲線，掃描速率：l〇〇mV/s。
[0028] 圖 8(a)為 G〇-CS-AChE/GCE，在 4°C下，保存不同時間后，在 0· lmol/LPBS(c(ATCl) =1.0 mmol，pH = 7. 0)中的循環伏安曲線圖，掃描速率：100mV/s。