一種羥丙基殼聚糖取代度的測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于羥丙基殼聚糖取代度的檢測方法研究及應用領域，涉及一種羥丙基殼 聚糖取代度的測定方法，具體涉及一種紅外吸收光譜法測定羥丙基殼聚糖取代度的方法。
【背景技術】
[0002] 殼聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性、穩定性、安全性，但其水溶性較差， 只能溶于酸性介質，而將殼聚糖羥丙基化生成羥丙基殼聚糖，則可改善其溶解性，從而大大 拓寬其應用領域與開發進程。經研究表明，羥丙基殼聚糖具有溶解性、吸濕性、保濕性、成 膜性、起泡性、清除自由基、抗菌性、吸附性（Cheng Z，et al. Effects of hydroxypropyl degree on physiochemical activities of chitosan from squid pens.International Journal of Biological Macromolecules, 2014, 65:246 - 251 ；Dong Y, et al. Influence of degree of molar etherification on critical liquid crystal behavior of hydroxypropyl chitosan. European Polymer Journal, 2001, 37(8):1713 - 1720), 在 醫藥、化妝品、食品、造紙、紡織等領域均有廣泛應用前景（宋福來等.殼聚糖即型水凝 膠的理化性質、止血功能和生物相容性研究.功能材料，2014, 45(9) :09065-09069 ;高 興爽等.羥丙基殼聚糖的制備、表征及其對角膜細胞生長的影響.中國海洋大學學報， 2007, 37:131-134;唐新峰.羥丙基殼聚糖制備及其作為中性造紙助劑的應用.武漢大學 碩士論文，2005 ;季莉.HPCTS的制備與性能及其在織物整理上的應用研究.四川大學碩 士論文，2005;袁毅樺等.羥丙基殼聚糖的制備及其吸濕，保濕性研究.精細與專用化學 品，2005 ;Zhang L,et al. Effect of orally administered hydroxypropyl chitosan on the levels of iron,copper, zinc and calcium in mice. International Journal of Biological Macromolecules, Volume 64, March 2014, Pages 25 - 29)。
[0003] 當發現羥丙基殼聚糖具有如此潛在的應用價值，相關研究人員必然會進一步研究 羥丙基在殼聚糖上的取代度（羥丙基殼聚糖分子中每個氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖 分子上連接的羥丙基的數量）對羥丙基殼聚糖性能及其應用的影響，然而，卻鮮見這方面 的研究報道。即便有文獻報道，如發表在《中國海洋藥物》上的"不同取代度的羥丙基殼聚 糖生物降解性研究"(2004, 1:33-36)只是采用了《中國藥典》二部的羥丙基的測定方法，即， 通過氧化聯合堿滴定法，但并未見取代度測試結果。國外文獻Effects of hydroxypropyl degree on physiochemical activities of chitosan from squid pens.International Journal of Biological Macromolecules, 2014, 65:246 - 251 ；Dong Y, et al. Influence of degree of molar etherification on critical liquid crystal behavior of hydroxypropyl chitosan. European Polymer Journal, 2001, 37 (8) :1713 - 1720)在研究 取代度問題時，主要以元素分析法為主。
[0004] 目前有文獻報道的羥丙基殼聚糖取代度的測定方法有元素分析法（張永 勤，張坤.元素分析法同時測定羥丙基殼聚糖的取代度和水分.分析試驗室，2014， 33(8) :978_980)、核磁氫譜法（Dong Y，et al. Influence of degree of molar etherification on critical liquid crystal behavior of hydroxypropyl chitosan. European Polymer Journal，2001，37 (8) : 1713 - 1720 ;Peng Y，et al.Preparation and antimicrobial activity of hydroxypropyl chitosan.Carbohydrate Research，2005, 340 (11) :1846 - 1851)和已公開的吸光光度法（專利【申請號】 201410841212. 2)。
[0005] 羥丙基殼聚糖一般為高分子聚合物，分子內、分子間不同基團相互作用復雜，因 此，在核磁共振氫譜的分析方法中，用不同化學位移處氫質子的相對吸收強度來定量計算 對應環境下的氫質子數量很容易引入誤差，而顯著影響了取代度的準確計算。而元素分析 法只用到樣品中的C，N質量比，并將的測量值與計算值相對照，參數單一且不受樣品取 代度高低以及水分含量的影響，因此，常用于該取代度其它測定方法的參照與比較研究。上 述兩種方法檢測成本均較高，不適于作為羥丙基殼聚糖生產企業和研究單位的大批量常規 檢測。
[0006] 紅外吸收光譜法的檢測成本相對較低、且無須精密稱取、溶解殼聚糖樣品，操作簡 便快捷，特別是還可適用于手持式紅外吸收光譜儀，因此，該法對羥丙基殼聚糖的生產企業 的質量控制和應用性研發、質檢部門的快速檢測、科研院所的科學研究具有重大意義。
[0007] 然而，國內外自八十年代即開始了對羥丙基殼聚糖的研究，研究者普遍應用其 紅外吸收譜圖作為結構表征的方法之一，但迄今為止卻未見利用該法測定羥丙基殼聚 糖取代度的相關報道。究其原因，一方面羥丙基殼聚糖樣品中的極微量雜質即可使其 紅外光譜圖"明察秋毫"而顯現出來，并且直接影響特征峰的峰形和峰位變化（張永勤， 張坤.分離純化方法對羥丙基殼聚糖結構及取代度測定的影響.青島科技大學學報， 2015, 36(3) :251-254);另一方面，羥丙基化本身也會使其因各特征峰相互交疊、變形、迀移 等，而很難找到恒定的某結構特征峰作為參比峰用于取代度的計算。因此，在確定甲基特征 峰作為分析峰的前提下，尋找合適的參比峰以及確定二者的積分方法也是本發明的關鍵。
【發明內容】
[0008] 為了解決上述現有技術的不足，本發明首要目的在于提供一種簡便快速、準確、低 成本的羥丙基殼聚糖取代度的檢測方法。
[0009] 本發明的目的通過以下技術方案來實現：
[0010] -種羥丙基殼聚糖取代度的測定方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0011] ⑴干燥羥丙基殼聚糖樣品以除去水分，其中每個樣品均通過羥丙基化反應和脫堿 法純化制得，并來源于脫乙酰度已知的同一原料殼聚糖和/或脫乙酰度與該原料殼聚糖相 差不超過3%的殼聚糖；
[0012] ⑵建立檢測模型
[0013] a.利用紅外吸收光譜儀獲得步驟⑴中干燥過的具有不同取代度的羥丙基殼聚糖 樣品的紅外吸收光譜圖；
[0014] b.利用紅外吸收光譜儀的應用軟件，從a步驟中所得到紅外吸收光譜圖測得以整 個波形3880-1880cm 1的波谷連線為基線BLl的甲基特征峰2971-2962cm 1的峰強度的吸光 度值Al ;測得包括酰胺特征峰和氨基特征峰在內的整個波形1740-1515CH11的面積的吸光 度值A2,以其波谷連線為基線BL2 ;從而得到Al與A2的比值的100倍的對數X ;
[0015] c.以標準方法測得羥丙基殼聚糖樣品的取代度Y ;
[0016] d.以b步驟中所得到的比值X對c步驟中所得到的羥丙基殼聚糖樣品的取代度Y 建立線性良好的回歸模型，即Y = kX+b，從而獲得模型中k和b的具體數值；
[0017] ⑶檢測：將待測羥丙基殼聚糖樣品按照⑴的方法干燥，從⑵中a步驟得到紅外吸 收光譜圖，按照⑵中b步驟得到比值X，代入⑵中d步驟的線性回歸模型，即可通過計算得到 待測羥丙基殼聚糖樣品的取代度Y。
[0018] 優選地，干燥羥丙基殼聚糖樣品的方法為，于烘箱中在80°C干燥4-5小時，然后迅 速升溫至l〇5°C再干燥1. 5-2小時，取出于裝有氧化鈣的干燥器中備用。
[0019] 優選地，⑵中a步驟所使用的紅外吸收光譜儀為傅里葉變換紅外光譜儀，
[0020] 優選地，⑵中a步驟中所使用的紅外吸收光譜儀的檢測條件為：掃描范圍 4000-400cm \ 掃描 16-32 次，分辨率為 4cm 1C3
[0021] 優選地，在利用紅外吸收光譜儀測試羥丙基殼聚糖樣品之前進行背景檢測。
[0022] 優選地，對所述的紅外吸收光譜圖中的圖譜進行扣背景處理
[0023] 優選地，所述的標準方法為元素分析法。
[0024] 本發明與現有技術相比，具有如下優點：
[0025] ⑴操作簡便、快捷地檢測羥丙基殼聚糖的取代度；
[0026] ⑵無須對樣品進行精密稱量、溶解等步驟
[0027] ⑶還適用于手持式紅外吸收光譜儀的檢測
[0028] ⑷適用于生產企業對羥丙基殼聚糖產品的質量控制、應用型研發和質檢機構的樣 品檢測。
【附圖說明】
[0029] 圖1為殼聚糖和不同取代度的羥丙基殼聚糖的紅外吸收光譜圖（以透光率表示）。 〇號為殼聚糖樣品，1-7號為取代度依次遞增的羥丙基殼聚糖樣品。
[0030] 圖2為羥丙基殼聚糖的紅外吸收光譜圖（以吸光度表示）。
[0031] 圖3為圖2中羥丙基殼聚糖在4000-1400CII11范圍內的放大圖。其中Al為以整個 波形3880-1880cm 1的波谷連線為基線BLl的甲基特征峰的峰高的吸光度值，A2為包括酰 胺特征峰和氨基特征峰在內的整個波形1730-1530cm 1以其波谷連線為基線BL2的面積的 吸光度值。
[0032] 圖4為羥丙基殼聚糖取代度的線性回歸標準曲線，其中，X為Lg(100XAl/A2)，Y 為利用作為標準方法的元素分析法所測得的相應羥丙基殼聚糖樣品的取代度。
【具體實施方式】
[0033] 下面結合實施例對本發明作進一步的詳細描述，但本發明的實施方式不限于此實 施例，凡是不背離本發明構思的改變或等同替代均在本發明的保護范圍內。
[0034] 實施例1
[0035] 試劑：KBr為光學純，乙酰苯胺為標準物質，均來源于國藥試劑有限公司。殼聚糖， 來源于山東萊州