肽聚糖的生物學測定的制作方法
【專利說明】肽聚糖的生物學測定發明領域
[0001]本發明涉及一種樣品、具體地葡萄糖聚合物樣品中的肽聚糖的測定。
[0002]發明背景
[0003]無菌性炎癥性發病是在使用用于治療性目的(例如:腹膜透析，腸外營養，通過靜脈途徑注射)的制品治療期間觀察到的主要并發癥。盡管這些炎癥性發病中的一些與化學性質問題相關(化學污染物的意外存在或某些化合物的不適當劑量)，但大多數病例是由于在制造工藝期間釋放的微生物來源的污染物的存在所致。現已明確確認，脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)是主要污染物，在其以痕量水平存在于制品中時，其呈現觸發所述炎癥性發病的高風險。
[0004]許多質量控制實驗室以常規方式使用LAL(鱟(Limulus)阿米巴樣細胞溶解物)測定來檢測并測定LPS污染。這種測定是基于通過從鱟(Limulus))鱟(horseshoe crab))血淋巴提取的感測復合物對內毒素的識別。
[0005]目前提出同樣基于無脊椎動物血淋巴的提取物的反應性的其他測定用于檢測用于治療性應用的產品中的PGN(SLP-Wako，易默奈公司(Immunetics))。然而，這些測定具有并非極具特異性的缺點，因為其也與其他微生物來源的分子(例如β-葡聚糖)反應。此夕卜，這些方法需要購買用于這個用途的特殊設備，一般會增加成本并因此限制這些測定技術的獲得。
[0006]此外，LPS和PGN具有根據其細菌來源可變的結構，從而導致炎癥反應性出現巨大差異。這就是為什么另外需要以標準分子的當量單位表達這些測定的結果的原因(例如，該LAL測定中大腸桿菌(E.coli)的LPS)。
[0007]此外，這些分子最常以大分子復合物形式存在，這會影響其溶解性以及其炎癥潛能。例如，PGN的大小高度可變并且經常與細胞壁中的其他分子(例如脂磷壁酸和脂肽)聚集。
[0008]因此，已研發出只考慮與這些分子相關的炎癥負荷的“生物學”方法。炎癥反應的效應細胞具有用于識別感染源特異性產生的分子結構的特定感測器。這些稱為PAMP (病原體相關分子模式分子)的分子基本上由TLR(Toll樣受體)和NLR(Nod樣受體)識別，所述受體的特異性與不同種類的炎癥分子的分子結構相關。與LPS(其為由TLR4型受體識別的配體)相反，PGN是由TLR2型受體識別的配體。
[0009]近年來，已研發出活體外細胞測定來替代炎癥反應的動物模型。這些測定大多是基于在被污染產品的存在下培育單核細胞以及基于炎癥性細胞因子(TNF-α、IL-1 β、IL-6、IL-8, RANTES)的產生的反向滴定。然而，使用從血液分離的原代細胞的測定經受供體的顯著個體間差異性，此可導致實驗偏差。
[0010]與此相比，單核細胞細胞系給出恒定反應，這解釋了為什么其一般偏好原代細胞。然而，這些細胞系也并非完全令人滿意。例如，細胞因子的選擇經常被批評，因為大多數細胞因子是瞬時表達并且其在培養基中的濃度并非始終反映炎癥分子的真實負荷。由于所有這些單核細胞都表達大部分的TLR/NLR，所以基于其使用的測定對一種類型的污染物無選擇性，但將給出一個總體炎癥反應。
[0011]此外，由于這些細胞對不同炎癥分子的敏感性差異而產生嚴重問題。因此，TLR2配體PGN的反應性遠小于LPS，從而使得通過這些方法難以對其進行檢測。事實上，LPS在ng/mL級的濃度下誘導顯著反應，而獲得類似反應需要的PGN濃度要高100倍(w/w比率)。
[0012]數年中，已提出在用于對炎癥性化合物的反應性進行檢測和量化的生物學測定中用經轉染細胞系替代上述模型。通過編碼一類炎癥性激動劑的特異性受體的基因穩定轉染這些非炎癥性細胞系(例如:HEK-293)。其還含有用于編碼酶(例如，熒光素酶或堿性磷酸酶)的報道基因的表達載體，該酶的合成依賴于炎癥性受體的活化。因此，通過表達適當受體的細胞識別污染物將觸發該酶的合成，其產生之后將會使其底物轉變為有色或發光產物。由于這種產物易于量化，這種方法容許快速測定與一種類型的污染物相關的炎癥反應。
[0013]這些細胞模型具有多種優點:用酶測定替代細胞因子的ELISA測定，由于這些細胞系的穩定特征而使這些測定具有顯著再現性，隨所表達受體而變地靶向某些種類的炎癥分子，以極低閾值檢測污染物。
[0014]因此，這些細胞模型可替代活體外細胞因子反應測定，因為其使得可能特異性靶向作為給定TLR或NLR的激動劑的炎癥因子，并量化與這種激動劑相關的炎癥反應。例如，特異性表達TLR2和TLR4的細胞已用于檢測食品中的污染物(英國萊斯特大學心血管科學系(Department of Card1vascular Sciences of Leicester University-UK)的柯萊特艾瑞德(Clett Erridge)的著作英國營養雜志(British Journal of Nutrit1n)，第 105卷/第01期/2011年I月，第15-23頁)。
[0015]此外，諸如英瓦沃珍(InvivoGen)等公司現在銷售HEK-293細胞系(HEK-Blue?)的眾多種經不同TLR或NRL受體轉染的細胞。這些細胞含有編碼堿性磷酸酶的分泌形式(SEAP:分泌的胚胎堿性磷酸酶)的基因作為報道基因，其容許對炎癥性激動劑的反應進行快速并且簡單的比色測定。
[0016]這些HEK-Blue?細胞已成功地用于檢測葡萄糖聚合物濃縮溶液中的污染物的存在和其協同效應(W02012/143647)。由于本申請案中陳述的目標只是檢測呈展示炎癥性活性的形式的污染物，所以本專利申請案中描述的方法不適合于測量樣品中所含PGN的總量。事實上，可溶PGN(MM?120kDa)是那些通過TLR2受體誘導炎癥反應者。因此，本申請案中所述方法不檢測對于具有炎癥性或與其他分子聚集不具有適宜大小的PGN。
[0017]因此，業內仍需要研發測定樣品、特別是葡萄糖聚合物樣品中的總PGN的替代性方法。
[0018]發明概述
[0019]因此，本發明涉及一種測定樣品、特別是葡萄糖聚合物樣品中的肽聚糖的生物學方法。
[0020]具體地，本發明涉及一種測定葡萄糖聚合物樣品中的肽聚糖(PGN)的方法，其包含:
[0021]a)通過聲處理、加熱和/或堿性化處理該葡萄糖聚合物樣品；
[0022]b)使處理后的樣品或其稀釋物與重組細胞接觸，該重組細胞表達外源TLR2受體(Toll樣受體2)和直接依賴與該TLR2受體相關的信號傳導路徑的報道基因，所述報道基因編碼有色或熒光蛋白質或編碼其活性可用或不用底物來測量的蛋白質；
[0023]c)測量該報道基因信號；和
[0024]d)使用PGN的量與該報道基因信號的強度之間的對應性的校正曲線來確定該樣品中的PGN的量。
[0025]優選地，通過聲處理、加熱和/或堿性化處理該樣品使得可能破碎并分解該樣品中所含PGN，具體地以使得其能活化該TLR2受體。具體地，該樣品的處理使得可能生成主要具有約120kDa大小的PGN。
[0026]優選地，該報道基因是分泌堿性磷酸酶。在一個優選實施例中，該細胞是HEK-Blue? hTLR2細胞系的細胞。
[0027]優選地，PGN的量與該報道基因信號強度之間的對應性的校正曲線是用源自選自以下的細菌的PGN來制備:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus)、枯草桿菌(Bacillus subtil is)和酸熱脂環酸芽抱桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)，優選地源自金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和酸熱脂環酸芽孢桿菌。具體地，該方法可包含使用源自選自以下的細菌的PGN制備該校正曲線的預備步驟:金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、枯草桿菌和酸熱脂環酸芽孢桿菌，優選地源自金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和酸熱脂環酸芽孢桿菌。
[0028]優選地，如果需要，稀釋該樣品，以生成對應于該校正曲線的線性部分的報道基因信號。
[0029]優選地，該樣品是艾考糊精(icodextrin)溶液樣品。
[0030]優選地，用內標對PGN的量與該報道基因信號強度之間的對應性的校