官能化表面的量化的制作方法
【專利說明】官能化表面的量化
[0001] 本發明涉及量化使表面官能化的至少一種官能團的方法。
[0002] 官能化表面是用于生物傳感技術的重要工具。因此，需要評估表面官能化的方法 以保證這些技術的可靠性，并且質量控制方法可用于提供具有經證實的有效性和精度的技 術。
[0003] 不同的官能團已被描述為將生物材料連接至表面上的有效實體。這些材料可接枝 到存在例如胺（-NH2)、羧酸（-C00H)或其衍生物或者羥基（-OH)的表面上。那些化學官能 團能夠使用來自文獻的完善的偶聯方案將大范圍的分子共價結合到表面上。
[0004] 從制造的視角而言，在官能化表面上的某些官能團（如表面-COOH基團）的檢測 和表征尚不完善，而且許多常規的表征技術在精確性和日常使用上存在一些缺點。實際上， 首先，那些方法（如紅外光譜和X射線光電子能譜（XPS))運行昂貴，其次，由于被設計用于 靶向帶電的表面而不是特定官能團，因此它們通常呈現出低特異性。因此，就接枝有羧酸的 表面而言，那些方法經常無法將羧酸與其他含氧官能團區分。而且，當將如上所述的方法用 于小尺寸表面時，其通常不適合提供信息。
[0005] 存在其他新興技術。一種這樣的方法依賴于比色活性或熒光分子在帶電表面上 的吸附 / 解吸。例如，如 WANG, Y.的文章（Surface graft polymerization of SU-8 for bio-MEMS applications, Journal of Micromechanics and Microengineering. 2007, vol .17, pages 1371,1380)中提及的，一種方法描述了在帶負電的表面上吸附帶正電的甲苯胺 藍0。一般而言，此類方法由在吸附至表面后將本體溶液中剩余的分子量化，或在解吸后將 從表面上洗脫的分子量化而構成。雖然此類方法可以應用于任何帶電表面（低特異性），但 量化步驟無法準確地區分比色活性或熒光分子的特異性和非特異性結合。對于微米范圍或 更小的表面，消耗的百分比太小以至于無法準確地評估。
[0006] 稱為表面物類焚光標記（FLOSS)的方法是羧基衍生表面官能團的表征的一種有 吸引力替代方法。在這方面，XING, Y. (Specificity and sensitivity of fluorescence labelling of surface species, Langmuir. 2007, vol. 23, pages 684,688)中公開了以下 工序，其通過反應后清洗工序在還包含羧酸基團的表面上選擇性地標記醛基而有效地去除 非特異性成鍵（弱的和離子成鍵），以使通過胺改性染料對醛基的標記將不會受到-C00H 基團存在的影響。當涉及到選擇性表征-C00H基團時，PELLENBARG，T. (Detecting and quantifying oxygen functional groups on graphite nanofibers by fluorescence labelling of surface species, Carbon 2010, vol. 48, pages 4256,4267)描述了焚光分 子，其特異性地和-COOH基團反應以便通過形成共價鍵來標記表面。
[0007] 隨后通過熒光光譜法來表征上述標記的表面。雖然表面官能團密度可直接通過 FLOSS方法由所述表面來測量，但其僅可用于相對較大的表面（毫米的范圍）。對于微米范 圍或更小的表面，我們觀察到所述方法是非定量的，并且對于一個給定的表面，測得的熒光 可能對應于兩種官能團濃度。因此，FLOSS方法不適用于微米范圍或更小的表面。到目前 為止，當涉及到表征微米范圍或更小的表面時，沒有提出克服這些問題的解決方案。
[0008] 本發明旨在彌補上述的全部或部分缺點。
[0009] 本發明通過提供一種量化使表面官能化的至少一種官能團的方法來實現這些目 的，所述方法包括如下連續的步驟：
[0010] a.提供具有微米尺寸并且被至少一種官能團官能化的微粒的至少一個表面，
[0011] b.使所述表面和溶液接觸，
[0012] i.所述溶液至少包含第一濃度的第一試劑和第二濃度的第二試劑，所述第一濃度 與第二濃度之間的比例是預定的；
[0013] ii.所述第一試劑和第二試劑被設計為以各自親和力選擇性地偶聯到所述至少一 種官能團中的一種，所述親和力的比例是預定的；
[0014] iii.所述第一試劑被標記用于發射熒光，而所述第二試劑未被標記；
[0015] 測量偶聯到表面的所述第一試劑的熒光并通過使用測量的所述第一試劑的熒光 和所述預定的比例來量化所述官能團。
[0016] 另外，通過避免用常規方法觀察到的自猝滅問題，本發明通過使官能化的表面與 包含第一濃度的被標記的第一試劑和第二濃度的未被標記的第二試劑的溶液接觸而解決 了所述問題。實際上，當官能化的表面與該溶液接觸時，所述第一試劑和所述第二試劑會與 接枝到表面的官能團進行反應，并且通過第一試劑和第二試劑各自與官能團的親和力而驅 動偶聯反應。另外，所述第一試劑還包含設計用于發射熒光的熒光分子。因此，該表面的所 述官能團與所述第一試劑偶聯，或與所述第二試劑偶聯，以致各個官能團與第一試劑偶聯， 或者與未標記的第二試劑偶聯。因此，本發明所述的方法使第一試劑在目標表面上物理間 隔開，由此避免自猝滅現象。
[0017] 本發明所述的方法還允許量化表面上的官能團。實際上，首先，第一試劑的濃度和 第二試劑的濃度是預定的參數。其次，上述各自的親和力比例提供了關于第一試劑和第二 試劑與官能團的親和力的信息。因此，在測量表面的熒光后，可通過考慮第一試劑和第二試 劑之間的濃度比例以及各自與官能團的親和力比例來量化存在的目標官能團。
[0018] 本發明所述的方法還允許量化接枝在表面上的不同的官能團。例如，本發明所述 的方法還允許獨立地量化被羥基（-OH)和胺基（-NH2)官能化的表面上的所有官能團。當 所述表面包含不同的官能團時，對于每個官能圖將選擇一對第一試劑和第二試劑以便特異 性地靶向所述官能團。所述第一試劑和第二試劑將處在預定的濃度比例，并將呈現各自與 所述官能團的預定親和力。
[0019] 根據一個實施方式，所述方法在步驟a)之前還包括活化步驟以便活化表面的官 能團。該實施方式旨在準備被設計用于與第一試劑和第二試劑偶聯的官能團。因此，通過 此活化步驟可引發接枝在所述表面上的官能團的反應活性。在此活化步驟之后，對于第一 試劑和/或第二試劑無活性的官能團可轉化為準備就緒與第一試劑和/或第二試劑偶聯的 反應活性官能團。
[0020] 在一個實施方式中，所述活化通過至少一種化學反應進行。因此，該化學反應允許 促進或引發第一試劑和第二試劑與官能團的偶聯。這種化學活化易于實現。
[0021] 根據一個實施方式，所述第一濃度和第二濃度之間的比例為約1:99~約50:50， 優選為約2:98~約25:75,更優選為約3:97~約10:90,且更優選為約4:96~約7:93。
[0022] 根據一個實施方式，所述表面包含在微粒上。大量微粒可同時被測量以提供關于 單個微粒上的官能團密度的信息。另外，所述方法能夠在單次測量中具有關于一個特定群 體或具有不同編碼的不同群體之間的詳細信息。
[0023] 在一個實施方式中，所述第一試劑和/或所述第二試劑選自蛋白質、抗體、多肽、 核酸或它們的混合物。
[0024] 根據一個實施方式，所述官能團是選自羧酸或其衍生物、酮類、醛類的羰基。因此， 在此實施方式中，第一試劑和第二試劑可通過使用被設計為與此實施方式所述的至少一種 官能團偶聯的任何基團而與所述官能團偶聯。
[0025] 在一個實施方式中，所述第一試劑和/或第二試劑通過肽鍵與表面的官能團偶 聯。
[0026] 根據一個實施方式，所述第一試劑和/或第二試劑具有胺基，所述胺基參加與表 面的官能團的偶聯。因此，根據此實施方式，官能團可選自被設計為與胺基偶聯的任何官能 團。
[0027] 在一個實施方式中，所述