一種胸腔積液中揮發性有機物的分析方法
【專利說明】-種胸腔積液中揮發性有機物的分析方法 (-)技術領域
[0001] 本發明設及一種胸腔積液中揮發性有機物的分析方法，具體設及通過基于頂空固 相微萃取技術化S-SPM巧結合冷阱聚焦-氣相色譜質譜（GC/M巧聯用的方法快速準確地分 析胸腔積液中的揮發性有機物。 (二）【背景技術】
[0002] 胸腔積液（PleuralEfTusion)是肺部疾病最為特異的人體體液，是機體內多種疾 病在胸膜上的反映，主要由肺部病變直接產生，與疾病發展關系密切。正常人胸膜腔內也有 少量的液體，在呼吸運動時起潤滑作用，一般正常人每24小時有500~lOOOmL的液體形成 與吸收。胸膜腔內液體自毛細血管的靜脈端再吸收，其余的液體由淋己系統回收至血液，濾 過與吸收處于動態平衡。若由于局部病變破壞了此種動態平衡，致使胸膜腔內液體形成過 快或吸收過緩，臨床上就產生了胸腔積液。根據發病原因，胸腔積液一般可分為良性和惡性 胸腔積液。惡性胸腔積液是腫瘤患者特別是肺癌患者常見的臨床問題，良惡性胸腔積液的 診斷和治療一直是困擾臨床醫生的一大難題。
[0003] 目前臨床應用的胸腔積液腫瘤標志物主要是基因表達產物和蛋白類物質，而對揮 發性有機物鮮有報道。基因表達產物、蛋白類物質檢測手段有高效液相色譜質譜法、核磁共 振、電泳等方法，而揮發性有機物主要W氣相色譜質譜為主。本發明建立了一種能較全面反 映胸腔積液中的小分子揮發性有機物的HS-SPME-冷阱聚焦-GC/MS法，同時對各揮發性有 機物進行定性和半定量分析，比較其在肺癌和肺部良性疾病患者胸腔積液中的差異性，對 篩選出潛在的肺癌標志物及辨別良惡性胸腔積液具有重要的參考意義和實際應用價值。 (H)
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種新穎的頂空固相微萃取化S-SPME)-冷阱聚焦-氣相色 譜質譜（GC/M巧聯用對胸腔積液中的揮發性有機物進行定性、半定量分析的方法，在此基 礎上對各物質在良惡性胸腔積液中存在與否及含量高低進行比較，從而評價它們在良惡性 胸腔積液甚至肺癌患者胸腔積液的診斷中的價值，W及是否有作為特異性和靈敏度更高的 腫瘤標志物的潛能。
[0005] 為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0006] -種胸腔積液中揮發性有機物的頂空固相微萃取-冷阱聚焦-氣相色譜質譜聯用 的分析方法，所述的分析方法為：將胸腔積液樣品、氯化鋼固體、攬拌磁子加入具有聚四氣 乙締膜隔墊的頂空瓶中，在40~60°C、500~900rmp攬拌下，用CAR/PDMS纖維的萃取頭進 行頂空固相微萃取，萃取15~30min后，迅速將萃取頭插入氣相色譜進樣口解析，此時氣相 色譜柱靠近柱頭的部分浸泡在盛有液氮的容器中形成冷阱聚焦，解析2~5min后，將氣相 色譜柱靠近柱頭的部分從盛有液氮的容器中取出，同時將萃取頭從氣相色譜進樣口取出， 啟動氣相程序進行GC/MS檢測分析，氣相色譜質譜聯用儀的工作條件為：
[0007] 氣相色譜條件為泡譜柱為弱極性柱，選用UA-5金屬毛細管柱，規格30mX0. 25mm i.d.X0.25i^m膜厚，5%苯基甲基聚硅氧烷；柱箱：初溫35°C，保持3~10min，W5~ 10°C/min速率升到80~120°C，再W10~15°C/min速率升到220~250°C;進樣口溫度 為230°C~300°C;進樣方式采用前0. 1~1.Omin不分流進樣；載氣為氮氣，流速1. 0血/ min；
[0008]質譜條件為：電子轟擊離子源，電離能量為70eV，離子源溫度200~250°C，傳輸線 溫度210~250°C，離子掃描范圍40~550m/z;
[0009] 分析過程得到胸腔積液樣品的總離子流圖和質譜圖，所得總離子流圖中每一個峰 代表胸腔積液樣品的一個揮發性有機物組分，并且每一個峰各自得到相應的質譜圖，通過 Nist2. 0質譜標準譜庫檢索每一個峰對應的質譜圖對胸腔積液中的揮發性有機物進行定 性分析，根據總離子流圖中每一個峰的峰強度，通過計算峰面積對胸腔積液中的揮發性有 機物進行半定量分析，從而得到胸腔積液中揮發性有機物的分析結果。
[0010] 本發明所述胸腔積液均采用胸腔穿刺術采集，用內置醫用冰袋的密封保溫盒將采 集的胸腔積液儲存于-20°c冰箱中，分析前取出解凍，離屯、并快速取上清液制成胸腔積液樣 品。
[0011] 本發明分析方法中，所述氯化鋼固體的用量為在胸腔積液樣品中達到飽和的量。
[0012] 優選所述氣相色譜條件為：色譜柱為弱極性柱，選用UA-5金屬毛細管柱，規格 30mX0. 25mmi.d.X0. 25ym膜厚，5%苯基甲基聚硅氧烷；柱箱：初溫35°C，保持3min，W 5°C/min速率升到80°C，再Wl〇°C/min速率升到230°C;進樣口溫度為250°C;進樣方式采 用前0. 7min不分流進樣；載氣為高純氮氣巧9. 99% )，流速1. 0血/min。
[0013]優選所述質譜條件為：電子轟擊離子源巧I)，電離能量70eV，離子源溫度210°C， 傳輸線溫度230°C，離子掃描范圍40~500m/z。
[0014] 本發明通過將氣相色譜柱靠近柱頭的部分浸入盛有液氮的不誘鋼杯中形成冷阱 聚焦，從而成功分離出高揮發性的有機物，提高了分析靈敏度，改善了譜帶展寬問題；具體 的，所述氣相色譜柱靠近柱頭的部分為：距離柱頭10~30cm長度處的一段5~15cm長度 的柱范圍。
[0015] 本發明分析方法檢測并定性出胸腔積液中的65種匹配度較高的揮發性有機物， 得到其檢出頻率及各物質類別的平均峰面積，分析比較了肺癌和良性疾病患者胸腔積液中 揮發性有機物的差異。
[0016] 與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在：頂空固相微萃取集萃取、富集及 進樣于一體，操作簡便，無需復雜的前處理過程，消除了生物樣品復雜的基質干擾，又不造 成樣本中組分信息的失真；冷阱聚焦技術使胸腔積液中高揮發性的有機物在低溫下冷凝和 二次解析，并在合適的色譜條件下得到有效的分離；該方法能夠快速檢測胸腔積液中的揮 發性有機物，并進行定性和半定量分析，再運用差異性分析對良惡性胸腔積液的辨別甚至 肺癌標志物的篩選有著十分重要的意義。 (四）【附圖說明】
[0017]圖1為胸腔積液在使用液氮冷阱聚焦前（a)、后化）的氣相色譜質譜圖；
[0018] 圖2為不同程序升溫條件下胸腔積液的氣相色譜質譜圖；
[0019] 圖3為S次平行測定得到的胸腔積液中揮發性有機物的服-SPME-冷阱聚焦-GC/ MS總離子流圖；
[0020] 圖4為肺癌（a,b)和結核性胸膜炎（c，d)患者胸腔積液中揮發性有機物的 服-SPME-冷阱聚焦-GC/MS總離子流圖；
[0021] 圖5為28例良惡性胸腔積液中各化學類別物質的平均峰面積柱狀圖；
[0022] 圖6為21個高檢出率有機物在癌癥組和炎癥組的平均峰面積柱狀圖；
[0023] 圖7a~7g為差異較大的7種有機物的平均峰面積分布箱形圖。 (五）【具體實施方式】
[0024] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步說明，但本發明的保護范圍并不僅限于 此。
[00巧]分析樣品：胸腔積液樣品均由浙江省人民醫院呼吸內科采用胸腔穿刺術采集。實 驗人員用內置醫用冰袋的密封保溫盒將樣品取回，儲存于-20°C冰箱中待用。分析前，將胸 腔積液樣品從-20°C的冰箱中取出，置于室溫下解凍。解凍完畢，將樣品管置于3000rmp的 離屯、機中離屯、lOmin，移取上層清液ImL于15mL預先放置磁力攬拌子且具有聚四氣乙締膜 隔墊的頂空瓶中，并稱取〇.38g化C1固體加入樣品中，制成待測胸腔積液樣品。所有肺癌 患者均為組織病理學確認的初診患者。
[0026] 分析裝置：美國lliermoFinniganTraceDSQ的氣相色譜/質譜聯用儀（GCHVB); 美國Supleco公司57330U型手動進樣SPME手柄及CAR/PDMS萃取纖維。
[0027] 實施例1出S-SPME-冷阱聚焦-GC/MS方法對胸腔積液樣品的分析
[002引 （1)實驗方法
[0029] 將上述裝有待測胸腔積液樣品的頂空瓶置于磁力攬拌器上，中速攬拌（SOOrmp) 并加熱至50°C，平衡3min后將75ymCAR/PDMS纖維的萃取頭伸出不誘鋼保護針管，暴露于 胸腔積液的上空，萃取20min后將萃取頭縮回針管，迅速將針管完全插入氣相色譜的氣化 室內并推出萃取頭，利用氣化室的高溫進行解析。期間，氣相色譜柱距離柱頭20cm長度的 一段10cm長度的柱范圍浸入盛有液氮的不誘鋼杯中形成冷阱聚焦，氣相進樣口分流閥關 閉。待解析3min后，移除盛有液氮的不誘鋼杯，同時將萃取頭從氣相色譜氣化室取出，啟動 氣相程序進行GC/MS檢測分析。
[0030] 氣相色譜條件為：進樣口溫度250°C，載氣為高純化巧9. 99% )，流速1. 0血/min， 前0. 7min不分流進樣。色譜柱溫度采用程序升溫方式：初始溫度為35°C，保持3min，W 5°C/min的速度升溫到80°C，再Wl〇°C/min的速度升溫到230°C。
[00