一種納米復合材料的電化學發光傳感器的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種電化學發光傳感器，尤其是涉及一種納米復合材料的電化學發光傳感器的制備方法。
【背景技術】
[0002]癌癥是一種威脅人類身體健康的重大疾病。根據有關部門調查，惡性腫瘤高居我國人口死亡原因第二位。目前世界上仍缺乏有效的治療手段來攻克癌癥，如果能夠實現對癌癥有效的早期診斷，這對后期的治療有著十分重要的意義，早期診斷是降低惡性腫瘤死亡率的主要途徑。腫瘤標志物(Tumor Marker)是反映腫瘤存在的化學類物質，它們在腫瘤組織中的含量大大超過在正常組織里的含量，它們的存在或量變可以提示腫瘤的性質，借以了解腫瘤的組織發生、細胞分化、細胞功能，以幫助腫瘤的診斷、分類、預后判斷以及治療指導。臨床診斷主要通過監測人體中腫瘤標志物的含量，以分析病人的病程、療效、復發及預后等。現階段檢測腫瘤標志物的主要方法有:酶聯免疫分析法、熒光免疫分析法、放射免疫分析法、化學發光免疫分析法和電化學免疫分析法等等。這些傳統的分析方法雖然特異性強、靈敏度高，但也存在一些不足之處，如:操作流程復雜、耗時較長、后續數據處理復雜和儀器設備昂貴等等。因此，設計一種新型的免疫傳感器，實現對低濃度腫瘤標志物的簡單、快速、靈敏、準確檢測，對保護人類健康有著相當重大的現實意義。
[0003]中國專利CN104155445A公開了一種無標記電化學發光免疫傳感器的制備方法及在腫瘤標志物的檢測中的應用，利用新型微納米材料NH4CoPOJt為基底，使得魯米諾--過氧化氫發光體系的發光穩定性大大增強，同時利用棒狀的金@銀核殼納米粒子作為生物模擬酶催化發光體系，從而制備了一種成本低、靈敏度高、特異性好、檢測快速、制備簡單的檢測腫瘤標志物的無標記電化學發光免疫傳感器。上述組分中所用的基底材料是NH4CoPO4,相比較于該材料，本申請采用綠色方法合成的仿生材料AuOBSA作為傳感器的固載體，成功固載上發光物質Iuminol和Ant1-CEA分子。將該復合材料材料共價鍵合到電沉積金納米層修飾電極表面，使構建的傳感器具有生物相容性好，導電性好，靈敏度高等特點。另外，對比該專利(CN104155445A)采用非共價地靜電組裝法制備無標記電化學發光免疫傳感器，本申請采用共價鍵合法來構建電化學發光傳感器，將有利于提高傳感器穩定性測試性能。
【發明內容】
[0004]本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種生物相容性好、特異性強、靈敏度高和檢測范圍寬的納米復合材料的電化學發光傳感器的制備方法。
[0005]本發明的目的可以通過以下技術方案來實現:
[0006]—種納米復合材料的電化學發光傳感器的制備方法，采用以下步驟:
[0007](I)在室溫攪拌下，將HAuCl4溶液和牛血清白蛋白溶液混合均勻，在劇烈攪拌的條件下，向混合的溶液中快速加入水合肼，反應完全之后，陳化12小時，將得到的產物離心分離后，用蒸餾水和乙醇交替洗滌，最終將洗后的產物冷凍干燥制備得到的AuOBSA納米材料；
[0008](2)利用戊二醛的交聯作用，將發光物質魯米諾化學交聯到AuOBSA納米材料表面，進一步活化AuOBSA表面的羧基以連接CEA抗體，制備得到復合材料Iuminol-AuOBSA-ant1-CEA ；
[0009](3)利用電沉積的方法，在工作電極裸玻碳電極表面電沉積一層金納米層，通過Au-S鍵的作用將得到的復合材料luminol-Au@BSA-ant1-CEA連接到電極表面，得到對抗原CEA具有靶向作用的電化學發光免疫傳感器。
[0010]步驟⑴中HAuCl4、牛血清白蛋白和水合肼之間的重量比是20?30:10?20:5?10。
[0011]步驟(2)具體采用以下步驟:
[0012](2-1)將AuOBSA納米材料與戊二醛混合后在室溫的條件下，搖床反應2_4h，然后將離心得到的產物利用超純水洗三次，去除未反應的試劑；
[0013](2-2)將得到的沉淀物超聲溶解到pH為7.4的PBS溶劑中，加入魯米諾溶液搖床反應2_4h，得到AuOBSA-1uminol納米材料；
[0014](2-3)利用二次蒸餾水對得到的AuOBSA-1uminol納米材料進行水洗，然后與EDC、NHS共同溶解在pH為7.4的PBS溶劑中，攪拌反應以活化AuOBSA-luminol表面的羧基，然后將Ant1-CEA加入到上述的混合溶液中，冰水浴的條件下攪拌過夜，將離心得到的產物利用二次蒸饋水洗凈，即得到復合材料luminol-Au@BSA-ant1-CEA。
[0015]步驟(2-1)中，AuOBSA納米材料與戊二醛的重量比為30:1?2。
[0016]步驟(2-2)中，沉淀物與魯米諾的重量比為3:1?2。
[0017]步驟(2-3)中，AuOBSA-1uminol納米材料、EDC、NHS、Ant1-CEA 的重量比為 400 ?500:40:40:1 ?2。
[0018]步驟⑶具體采用以下步驟:
[0019](3-1)用0.3 μ m及0.05 μ m Al2O3拋光粉對裸玻碳電極進行拋光，拋光好的電極在分別在二次蒸餾水和乙醇中各超聲2min，除去殘余在電極表面的Al2O3顆粒，再用N2吹干；
[0020](3-2)干燥的電極置于HAuCl4溶液中，在恒電位為-0.2V的條件下，在電極表面電沉積一層金納米層，電鍍時間為300s ；
[0021](3-3)常溫下，將復合材料luminol-Au@BSA-ant1-CEA滴加到金納米層表面，避光靜置4h，利用Au-S的作用，將Iuminol-AuOBSA-Ant1-CEA納米復合材料鍵合到金納米層的表面。
[0022]與現有技術相比，本發明采用綠色仿生材料AuOBSA作為固載體。綠色合成的AuOBSA具有生物相容性好，比表面積大和導電性好等特點，使構建好的免疫傳感器具有特異性強、靈敏度高和檢測范圍寬等優點。本申請采用共價鍵合法來構建電化學發光傳感器，將有利于提高傳感器穩定性測試性能，除此之外，相比較其他方法而言，本實驗構建傳感器的方法快速、簡便，為腫瘤早期診斷及其他腫瘤標志物的檢測提供了新的方法。
【附圖說明】
[0023]圖1為制備得到的AuOBSA納米微球的TEM照片；
[0024]圖2為不同的納米粒子的Zeta電位圖；
[0025]圖3為不同濃度的CEA(ng/mL)修飾的傳感器的電化學發光強度圖。
【具體實施方式】
[0026]下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。
[0027]實施例1
[0028]實驗試劑
[0029]魯米諾(>98% )購買自上海生物生工股份有限公司。氯金酸(HAuCl4.3H20)購買于薩恩化學技術(上海)有限公司(安耐吉)。無水乙醇(CH3CH2OH, AR)、水合肼(N2H4.H2O)和戊二醛(25% ,GA)購買自上海化學試劑品有限公司。牛血清白蛋白(BSA，純度>99.8%，分子量68000)購買自廈門星隆達化學試劑有限公司。乙基-(3-二甲基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-輕基琥泊酰亞胺(NHS)購買自Sigma-Aldrich公司。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)和CEA抗體購買自上海領潮生物有限公司。實驗所用水為去離子水(18.2M Ω )。
[0030]二、AuiBSA納米微球的制備
[0031 ] 向50mL 5.0mg/mL的BSA溶液中加入20mL氯金酸溶液(28.43mM)，室溫下劇烈攪拌lOmin。之后，在攪拌的條件下0.05mL N2H4.H2O,反應30min后，陳化12h。反應結束之后，產物在15000rpm離心15min，得到黑色固體。得到的固體，用蒸餾水和乙醇分別洗滌三次，冷凍干燥12h，待測。
[0032]所制得的AuOBSA納米微球的TEM如圖1所示。
[0033]三、Iuminol-AuOBSA-Ant1-CEA復合材料的制備
[0034]Iuminol-AuiBSA